電泳和轉(zhuǎn)膜

1. 取15ul樣品/孔上樣17%配體膠。

2. 按照制造商的說明進(jìn)行SDS-PAGE。

3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉(zhuǎn)到PVDF或硝化纖l維素膜。

免l疫印跡反應(yīng)和檢測（所有步驟都是在室溫下進(jìn)行，并不斷攪拌）

1. 將PVDF膜浸入100%甲l醇15s，然后在室溫放置5 min晾干。

注意：如果使用的是硝化纖l維素膜，此步省略。

2. 封閉：用TBST緩沖液配制5%的脫脂牛奶或者3%BSA在室溫下孵育1H進(jìn)行封閉，并需要恒定振蕩。

3. 孵育一抗：用TBST緩沖液配制的5%脫脂牛奶或3%BSA稀釋特異性識別Cdc42活性構(gòu)象的兔多克l隆抗l體（稀釋比例為1:50-1:1000，主要根據(jù)樣品中含有的Cdc42蛋白的量），室溫下孵育1-2小時(shí)，或者4°C條件下過夜孵育。

4. 用TBST緩沖液洗滌膜三次/5min。

5. 孵育二抗：（例如羊抗兔IgG-HRP），用TBST緩沖液配制的5%脫脂牛奶或3%BSA按1:1000稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育1小時(shí)并恒定振蕩。

6. 用TBST緩沖液洗滌膜三次/5min。

7. 使用實(shí)驗(yàn)者所選擇的檢測方法進(jìn)行顯色如ECL顯色法。

分析原理

NewEast Biosciences Arl1激l活檢測試劑盒基于配置特異性抗Arl1-GTP從細(xì)胞提取物或體外檢測活性Arl1-GTP水平的單克l隆抗l體GTPγS負(fù)載Arl1活化分析。簡而言之，抗活性Arl1小鼠單克l隆抗l體將用含有Arl1-GTP的細(xì)胞裂解液培養(yǎng)。然后，綁定的活動(dòng)Arl1將被下拉蛋白質(zhì)A/G瓊脂糖。用抗Arl1兔多克l隆抗l體或抗Arl1小鼠單克l隆抗l體進(jìn)行免l疫印跡分析，檢測沉淀的活性Arl1。

需要但未提供的材料

1刺激性和非刺激性細(xì)胞裂解物

2蛋白酶抑制素

4°C搖管器或振動(dòng)篩

40.5 M EDTA，pH8.0

51百萬氯化鎂

62X還原SDS-PAGE樣品緩沖液

7電泳和免l疫印跡系統(tǒng)

8免l疫印跡洗滌緩沖液，如TBST（10 mM Tris HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.05%

吐溫-20）

9免l疫印跡阻斷緩沖液（含5%脫脂奶粉或3%牛血l清白蛋白的TBST）

10PVDF或硝化纖維膜

11次級抗l體

12ECL檢測試劑

電泳和轉(zhuǎn)移

1向聚丙l烯酰胺凝膠（17%）中加入15μL/孔的下拉上清液。而且建議包括預(yù)染色MW標(biāo)準(zhǔn)（作為成功轉(zhuǎn)入的指標(biāo)步驟3）。

2按照制造商的說明進(jìn)行SDS-PAGE。

3按照制造商的說明，將凝膠蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF或硝化纖維膜上說明。

免l疫印跡檢測（所有步驟均在室溫下攪拌）

1在電印跡步驟之后，將PVDF膜浸入100%甲l醇中15次

然后在室溫下干燥5分鐘。

如果使用硝基纖維素，則應(yīng)跳過此步驟。

2室溫下用5%脫脂奶粉或3%牛血l清白蛋白在TBST中封閉1小時(shí)

不斷地?cái)噭?dòng)。

用抗Arl1單克l隆抗l體孵育，新鮮稀釋1:50~1000

（取決于樣品中Arl1蛋白質(zhì)的含量）5%脫脂奶粉或3%

BSA/TBST，室溫下持續(xù)攪拌1-2小時(shí)或4o

過夜。

3用TBST清洗吸水膜三次，每次5分鐘。

4用二級抗l體（例如山羊抗鼠IgG，HRP結(jié)合物）培養(yǎng)膜，

在室溫下，在5%脫脂奶粉或3%BSA/TBST中新鮮稀釋1:1000，1小時(shí)

5用TBST清洗吸水膜三次，每次5分鐘。

6使用您選擇的檢測方法，如ECL。