人工酶與限制酶的區(qū)別是什么？

生物體內(nèi)的天然酶都是由幾百個(gè)氨基酸分子組成的蛋白質(zhì)。酶所以有那么強(qiáng)的催化作用，跟它特有的結(jié)構(gòu)有關(guān)。酶有一個(gè)活化中心，即它的催化基因。在化學(xué)反應(yīng)中，催化基因處在兩個(gè)底物小分子中間，把兩個(gè)小分子緊緊地拉在周圍，使它們結(jié)合起來。這就好比一個(gè)大人的兩只手拉住兩個(gè)小孩使他們親近。酶的這種作用能大大加速生物化學(xué)反應(yīng)。

在細(xì)菌內(nèi)存在的一類能識(shí)別并水解外源DNA限制性內(nèi)切酶，它具有很好的專一性，能識(shí)別DNA上的特定位點(diǎn)，將DNA的兩條鏈都切斷，形成黏性末端或平末端。DNA經(jīng)限制酶切割后產(chǎn)生的具有堿基互補(bǔ)單鏈的末端稱為黏性末端。限制酶的生物學(xué)功能在于降解外面侵入的DNA而不降解自身細(xì)胞中的DNA，因自身DNA的酶切位點(diǎn)經(jīng)修飾酶的甲1基化修飾而受到保護(hù)。限制酶較為穩(wěn)定，常用的約100多種并已轉(zhuǎn)化為商品。限制酶在分析染色體結(jié)構(gòu)、制作DNA的限制酶圖譜、測(cè)定較長(zhǎng)DNA序列以及基因的分離、基因的體外重組等研究中是不可缺少的重要工具酶。

限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。它可分為三類：

Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾（甲1基化）作用且依賴于ATP的存在。Ⅰ類酶結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識(shí)別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而Ⅲ類酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割DNA分子，然后從底物上解離。

Ⅱ類由兩種酶組成： 一種為限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶），它切割某一特異的核苷酸序列； 另一種為獨(dú)立的甲1基化酶，它修飾同一識(shí)別序列。Ⅱ類中的限制性內(nèi)切酶在分子克1隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識(shí)別長(zhǎng)度為4至6個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱特異核苷酸序列（如EcoRⅠ識(shí)別六個(gè)核苷酸序列：5'- G↓AATTC-3'），有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列。Ⅱ類酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中，有的在對(duì)稱軸處切割，產(chǎn)生平末端的DNA部分片段（如SmaⅠ：5'-CCC↓GGG-3'）；有的切割位點(diǎn)在對(duì)稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA部分片段稱粘性末端，如EcoRⅠ切割識(shí)別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端。

質(zhì)粒載體和外源ＤＮＡ中限制酶切位點(diǎn)的性質(zhì)

    如今，質(zhì)粒載體中限制酶切位點(diǎn)的種類極為繁多，因而通常都有可能找到某種帶限制酶切位點(diǎn)恰恰與外源ＤＮＡ部分片段本身毫無二致的載體。這就具備一個(gè)不可1比擬的優(yōu)點(diǎn)，也應(yīng)是可以用相應(yīng)的限制酶消化重組質(zhì)粒崦回收外源ＤＮＡ。另一種方案，則是把片段插入到載體中能產(chǎn)生匹配末端的任何位點(diǎn)中。例如，識(shí)別不同的六核苷酸的限制酶BamHl和BglⅡ產(chǎn)生具有相同突出末端的限制酶切片段，這樣用BglⅡ消化而制備的外源ＤＮＡ部分片段可以克1隆到用BanHl消化的質(zhì)粒中。這通常會(huì)使接合序列不能被曾用于外源ＤＮＡ或制備載體的任何一種酶所切開。然而很多清況下，用切點(diǎn)位于多克1隆序列側(cè)翼的限制酶進(jìn)行消化，可將片段從重組質(zhì)粒中摘出。偶爾在質(zhì)粒的以及外源ＤＮＡ兩端的限制酶切位點(diǎn)之間，不可能找到“門當(dāng)戶對(duì)”的搭配關(guān)系。這時(shí)可用下面兩種方案加以解決：

   1）在線狀質(zhì)粒末端和（或）外源ＤＮＡ部分片段的末端接上合成在接頭或銜接頭。

   2）在得到控制的反應(yīng)條件下，用大腸桿1菌ＤＮＡ聚合酶I Ｋlenow片段部分補(bǔ)平帶3凹端的ＤＮＡ部分片段。如第九章所討論，這樣?？梢允鼓切┎幌嗥ヅ涞南拗泼盖形稽c(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa(bǔ)末端，從而促進(jìn)載體和外源ＤＮＡ的連接。因?yàn)椴糠盅a(bǔ)平的反應(yīng)消除了同一分子兩端彼此配對(duì)的能力，故連接反應(yīng)過程中環(huán)化和自身寡聚化的機(jī)會(huì)也會(huì)有所降低

藍(lán)白斑篩選鑒定

　　用于克1隆的酶還須通過額外的質(zhì)量鑒定――藍(lán)白斑篩選鑒定，以確定經(jīng)酶過量消化后DNA末端的完整性。該種鑒定方法為：用酶10倍過量消化適當(dāng)?shù)妮d體上lacZ基因中單一的酶切位點(diǎn)，連接，轉(zhuǎn)化，并涂XGal/IPTG/Amp平板。成功地切割、連接和表達(dá)b-galactosidase可以說明克1隆后基因是完整的，一個(gè)完整的基因產(chǎn)生藍(lán)斑，一個(gè)不完整的基因(例如，降解的DNA末端)產(chǎn)生白斑。在進(jìn)行藍(lán)白斑鑒定中，所有的限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的白斑數(shù)量不應(yīng)超過3%。