分子實(shí)驗(yàn)介紹——熒光定量PCR檢測(cè)

熒光定量PCR是檢測(cè)生物樣品中RNA含量的普遍的方法，通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。目前主要使用Sybr green和taqman法對(duì)RNA含量進(jìn)行檢測(cè)。Sybr green在低樣本量時(shí)成本較低，目前選用的較多。

SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料。當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來(lái)時(shí)，熒光信號(hào)急劇減弱。因此，在一個(gè)體系內(nèi)，其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過(guò)程是：1、開(kāi)始反應(yīng)，當(dāng)SYBR Green染料與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光。2、DNA變性時(shí)，SYBR Green染料釋放出來(lái)，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過(guò)程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)到熒光的凈增量加大。

實(shí)驗(yàn)流程：細(xì)胞或組織RNA提取-RNA濃度檢測(cè)-RNA逆轉(zhuǎn)錄-定量PCR檢測(cè)。

結(jié)果示例：

圖 A 基因擴(kuò)增曲線圖；B 基因擴(kuò)增溶解曲線圖；C mRNA相對(duì)表達(dá)量變化

從圖中可以擴(kuò)增曲線可以看出目的RNA擴(kuò)增效果，溶解曲線可以看出引物識(shí)別特異性情況，通過(guò)使用ΔΔCt方法計(jì)算可以得到每個(gè)組中目的mRNA表達(dá)變化。

免yi共沉淀（Co-IP檢測(cè)）是以抗ti和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的方法。當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用也被保留下來(lái)。用預(yù)先固化在beads上的蛋白質(zhì)A的抗ti免yi沉淀A蛋白，那么與A蛋白在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)B也能一起沉淀下來(lái)，再通過(guò)蛋白變性分離，對(duì)B蛋白進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而證明兩者間的相互作用。

腺相關(guān)病毒包裝原理

腺相關(guān)病毒( adeno-associated virus, AAV)是一類細(xì)小病毒, 基銦組為單鏈DNA ,對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有g(shù)an染能力。通常需要腺病毒或皰zhen病毒幫助其在體內(nèi)fu制擴(kuò)增。重組腺相關(guān)病毒( recombinant AAV, rAAV )是利用AAV2型基因組與不同xue清型的衣殼蛋白基因組結(jié)合產(chǎn)生的混合體病毒載體,可將目的基因的CDS區(qū)序列或者RNAi干擾序列插入rAAV表達(dá)質(zhì)粒中,包裝病毒后gan染細(xì)胞完成對(duì)目的基因的操作。腺相關(guān)病毒具有g(shù)an染溫和,免yi原性小,長(zhǎng)效穩(wěn)定表達(dá)的特點(diǎn),主要應(yīng)用于動(dòng)物體內(nèi)注射。源井生物提供的腺相關(guān)病毒顆粒經(jīng)過(guò)超su離心純化,并通過(guò)qPCR對(duì)病毒基因拷貝進(jìn)行滴定。腺相關(guān)病毒的滴度在10^12~10^13GC/ml ,可以滿足各類整體實(shí)驗(yàn)的使用要求。

STR檢測(cè)

短串聯(lián)重復(fù)(Short tandem repeats, STR)，又稱微wei星DNA(Microsatellite DNA)或簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple repeat sequence, SRS或SSR)，是廣泛存在于原核生物和真核生物基因組中的核苷酸重復(fù)序列。有絲分裂過(guò)程中DNA鏈之間的錯(cuò)配引起的fu制滑動(dòng)被認(rèn)為是導(dǎo)致STR產(chǎn)生的較為常見(jiàn)原因，并且依據(jù)不同fu制單元大小的不同以及不同物種之間，fu制滑動(dòng)發(fā)生的概率也不相同。

STR是以核心序列 (core repeat units) 首尾相連多次重復(fù)形成。每個(gè)STR的核心序列結(jié)構(gòu)相同，長(zhǎng)度為2-6bp，但其重復(fù)單位數(shù)目和重復(fù)區(qū)域的長(zhǎng)度不同，因此STR在不同種族、不同人群之間的分布具有差異性，構(gòu)成了STR遺傳多態(tài)性。不同個(gè)體之間在一個(gè)同源STR位點(diǎn)的重復(fù)次數(shù)也不同，因而同指紋識(shí)別一樣，STR位點(diǎn)分析也可對(duì)個(gè)體進(jìn)行身份識(shí)別。通過(guò)識(shí)別個(gè)體基因組在特定位點(diǎn)的特定序列重復(fù)，即可創(chuàng)建其基因檔案?；诖耍琒TR分析法已經(jīng)成為一種重要的鑒定分析方法，應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)、qin子鑒定及細(xì)胞鑒定等領(lǐng)域。