自噬流檢測

自噬是調(diào)節(jié)真核細鵬生長、和能量代謝的重要生物學(xué)機制。細胞自噬行使其生物學(xué)功能的前提是自噬流的話化。大量證據(jù)表明自噬流受損與多種慢性炎性疾病，特別是、神經(jīng)退行性疾病及組織纖維化的發(fā)病密切相關(guān)，目前對于自噬液的檢別是自噬與其相關(guān)疾病研究領(lǐng)域的熱點。由于自噬流是一個曲多個步驟組成的動態(tài)過程。因此往需要精細的突驗才能準確判斷自啦流狀態(tài)。

yao物對細胞的IC50檢測  

     IC50 (half maximal inhibitory concentration)是指被測量的拮抗劑的半抑制濃度。它能指示某一yao物或者物質(zhì)(yi制劑)在抑制某些生物程序(或者是包含在此程序中的某些物質(zhì)，比如酶，細胞受體或是微生物)的半量。在凋亡方面，可以理解為一定濃度的某種藥wu誘導(dǎo)腫liu細胞凋亡50%，該濃度稱為50%抑制濃度，即凋亡細胞與全部細胞數(shù)之比等于50%時所對應(yīng)的濃度，IC50值可以用來衡量yao物誘導(dǎo)凋亡的能力，即誘導(dǎo)能力越強，該數(shù)值越低，當(dāng)然也可以反向說明某種細胞對yao物的耐受程度。

軟gu細胞培養(yǎng)

(1)豚鼠脫頸處死，備皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮膚。

(2)無菌操作下取下雙側(cè)股骨頭及膝關(guān)節(jié)(保留周圍肌肉，軟gu不能暴露)，75%酒精浸泡5分鐘，轉(zhuǎn)移至PBS緩沖液中，帶入超凈工作臺，剔除關(guān)節(jié)周圍附著的軟組織，打開髖、膝關(guān)節(jié)，用尖刀削取關(guān)節(jié)軟gu組織，置入裝有PBS緩沖液的無菌培養(yǎng)皿，防止軟gu組織被風(fēng)干。

(3)PBS緩沖液充分漂洗軟gu小塊3次，然后用小剪刀將軟gu塊切碎至約Imm3大小。

(4)再次用PBS緩沖液沖洗3次，濾干，將細小的軟gu塊置入放有0.2%的II型膠原酶3ml的廣口瓶里，搖勻后置于37°C恒溫震蕩箱中消化，40分鐘后將上層消化液轉(zhuǎn)移至15ml規(guī)格離心管中，800r/min離心5min,收集細胞(沉淀物),加入含10%的胎牛xue清DMEM培養(yǎng)液4ml并吹打混勻，制成軟gu細胞混懸液。

(5)把消化所得的軟gu細胞混懸液收集于離心管中，經(jīng)濾網(wǎng)過濾后用細胞計數(shù)板計數(shù),并把細胞混懸液密度調(diào)整為2x105/ml接種于25cm2規(guī)格的培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶放置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)條件為37°C、5%CO2。

(6)未消化完的軟gu小塊繼續(xù)用II型膠原酶如_上法消化，直至軟gu塊基本消失。

(7)每日在倒置顯微鏡下觀察軟gu細胞生長情況并拍照保存。

BrdU染色原理

 BrdU (5-脫氧尿核苷)是胸腺的衍生物，常用于標記中新合成的DNA,可代替胸腺選擇性整合到細胞中新合成的DNA中(細胞周期S期)。這種摻入可以穩(wěn)定存在，隨著DNA進入子細胞中BrdU特異性可以用于檢測BrdU的摻入，從而判斷細胞的增殖能力。BrdU特異性可以用于檢測BrdU的摻入，從而判斷細胞的增殖能力。

注射或細胞培養(yǎng)后利用抗Brdu單，ICC染色，顯示增殖細胞。同時結(jié)合其它細胞標記物，雙重染色，可判斷增殖細胞的種類，增殖速度，對研究細胞動力學(xué)有重要意義。因組織細胞內(nèi)無內(nèi)源性Brdu存在，所以Brdu應(yīng)用較廣摻入雙鏈DNA內(nèi)的Brdu,以氫鏈與腺呤結(jié)合，不能直接與抗Brdu反應(yīng)，需經(jīng)解鏈使Brdu暴露方能被染色。常用的解鏈方法為鹽酸加熱、蛋白酶處理等，使DNA雙鏈部分單鏈化，抗Brdu小鼠單與增殖細胞核內(nèi)的Brdu結(jié)合，再經(jīng)酶標抗小鼠IgG孵育、



呈色，顯示進入S期細胞的情況。