如何用制備色譜柱制備低含量的雜質(zhì)？

制備色譜柱為ZorbaxSB-C18 9.4*250mm及gilson餾分收集器，色譜儀為Agilent1100或LC-6A。想用其制備面積歸一化法含量為0.05%左右的雜質(zhì)，初步提純后用高分辨的LC-MS進行定性分析。如何設(shè)定色譜條件，如，流量、進樣量、樣品的濃度、切割點的設(shè)置、是否要濃縮，要求將95%以上的主峰切除。

（主峰后有二個雜質(zhì)靠得很近。）

答：

1.制備用的流動相盡量等級高一點，否則流動相中的雜質(zhì)會影響LC-MS分析。

2.使用餾分收集器時，延遲體積一定要計算準確，檢測器的響應(yīng)時間設(shè)到很小，否則都會影響收集的純度和回收率。制備柱的流速一般與直徑的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速為1mL/min，9.4mm制備柱用1*（9.4/4.6）2,大約為4mL/min。進樣量設(shè)到幾個mg應(yīng)該基本沒有過載。進樣樣品濃度越高越好。假如進樣10mg，理論計算0.05%的雜質(zhì)大約只有5μg，顯然濃度太低，盡量是多做幾次，合并餾分然后濃縮后做LC-MS分析。

同一種填料的分析柱、制備柱按線形放大公式套，分離度會不會變化？

一般會有一定的變化，原因有以下幾點：

（1）制備柱的裝填是否均勻，如不均勻則可能產(chǎn)生渦流擴散使各個組分的經(jīng)過通道的直徑不同、阻力不一樣，停留時間不同，色譜峰可能變寬。

（2）如果樣品在流動相中溶解度小，在制備色譜上會有不同的峰展寬。

（3）如果樣品在分析柱上有展寬或拖尾的現(xiàn)象，放大到制備柱上后峰的展寬和拖尾經(jīng)常會非常嚴重，導(dǎo)致分離失敗。

制備色譜之DAC如何次次裝出高柱效

動態(tài)軸向壓縮柱（Dynamic Axial Compression Column，DAC）是工業(yè)化制備液相色譜分離的重要組成部分。當用戶填裝直徑50mm以上制備柱時，傳統(tǒng)預(yù)裝柱很難裝出高柱效和對稱性，另外預(yù)裝柱使用過程柱頭容易塌陷，導(dǎo)致柱效變差，無法滿足長期持續(xù)純化生產(chǎn)。DAC在運行過程中，活塞可以提供持續(xù)壓力，保證很優(yōu)的填裝柱床密度和穩(wěn)定性，從而長時間保持很佳分離效果。相比于預(yù)裝柱或彈簧柱，DAC可以輕松填裝和拆卸，實現(xiàn)不同填料反復(fù)填裝和輕松切換。有人說大柱子不用考慮柱效和對稱性，只要能分出樣品就行?，F(xiàn)實是色譜就是靠柱效來分離的，柱效越高，分離越好，載量越大，收率和得率越高。

通常制備色譜方法開發(fā)在4.6mm，10mm或20mm的半制備柱，然后放大到DAC50或DAC100, DAC200，DAC300, DAC450, DAC600或DAC800。理論上多大規(guī)模的色譜柱都可以實現(xiàn)與分析柱或半制備柱同樣的效率，在現(xiàn)實中，設(shè)計優(yōu)良的DAC柱效甚至高于預(yù)裝柱。只有柱效和對稱性類似才能保證了分離方法的線性放大。

工業(yè)制備色譜

以重組DNA技術(shù)為標志的現(xiàn)代生物技術(shù)是當代高科技的核心之一,其發(fā)展將改變醫(yī)學(xué)農(nóng)業(yè)、食品、能源、化學(xué)、環(huán)境等科學(xué)領(lǐng)域的傳統(tǒng)面貌，促進人類社會生產(chǎn)力和科學(xué)技術(shù)的巨大進步，通常，生物技術(shù)產(chǎn)品的分離、純化、直至得到符合需求的產(chǎn)品需要通過許多步驟才能實現(xiàn)。其中，吸附和液相色譜常常是其主要的、有時甚至是關(guān)鍵的分離技術(shù)之一。