Cell Counting Kit-8（簡(jiǎn)稱CCK-8）是一種基于WST-8的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的檢測(cè)試劑。WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧ji-4-硝ji苯j(luò)i)-3-(4-硝ji苯j(luò)i)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，是一種類似于MTT的化合物，它在電子載體1-甲氧ji-5-甲ji吩嗪鎓硫酸二jia酯（1-Methoxy PMS）存在的情況下，被線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物（formazan）。細(xì)胞增殖越多越快，顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺，對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺與活xi胞的數(shù)量成正比，因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。3x106細(xì)胞懸浮于15mlMEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，接種到200ml培養(yǎng)瓶中。

透射電鏡自噬小體檢測(cè)

胰酶消化，收集作用后的細(xì)胞，離心，先將細(xì)胞塊固定在2.5%成二醛和0.1%的PBS溶液中保存在4C中過夜。

再用乙醇梯度脫水，接下來用環(huán)氧樹脂浸透并切成薄片。隨后超薄切片用銅網(wǎng)固定，后用重金屬醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色。通過TEM分析凋亡細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)變化，拍照保存。

貼壁細(xì)胞:先倒出培養(yǎng)液，采用胰蛋白酶消化或者用細(xì)胞刮(會(huì)產(chǎn)生碎屑)刮下:帶培養(yǎng)液進(jìn)行離心，100-1500/mim 5 10min。離心完畢倒出培養(yǎng)液。25克胰酶蛋白酶(活力為1:250)，加入100ml無Ca2 、Mg2 的Hank's液溶解，濾器過濾chu菌，4°C保存,用前可在379C下回溫。管底的細(xì)胞團(tuán)不要打散， 沿管壁倒入適量(一般為材料體積的5-10倍)的2.5-3.5%成醒固定液，固定約1h-2h. 也可在4C冰箱過夜。

小鼠成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立

細(xì)胞之間的相互調(diào)控作用奠定基礎(chǔ).方法利用24 h內(nèi)新生小鼠顱骨和4~8周齡成年小鼠四肢長(zhǎng)分別分離、培養(yǎng)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，采用間接接觸的培養(yǎng)模式將接種了骨sui單核細(xì)胞的玻片或骨片置入提前24 h接種了成骨細(xì)胞的培養(yǎng)皿中進(jìn)行共培養(yǎng).共培養(yǎng)-定時(shí)間后進(jìn)行破 骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP染色鑒定和骨吸收功能檢測(cè)，并進(jìn)一 步采用RT- PCR對(duì)破骨細(xì)胞標(biāo)志酶基因基質(zhì)金屬蛋白酶.9(MMP-9)、TRAP 和組織蛋白酶K (Cathepsin K )的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果共培養(yǎng)5天后可觀TRAP( )多核細(xì)胞形成13天TRAP( )多核細(xì)胞數(shù)目達(dá)到高峰;骨吸收陷窩在共培養(yǎng)7天后開始出現(xiàn),隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),陷窩面積呈增加趨勢(shì);破骨細(xì)胞標(biāo)志基因TRAP在共培養(yǎng)3天時(shí)開始表達(dá)，而MMP-9和Cathepsin K則在共培養(yǎng)5天后表達(dá)結(jié)論共培養(yǎng)體系中成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞調(diào)控作用顯著誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞具有噬骨能力，該共培養(yǎng)模型可用于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的相互調(diào)控作用研究.