PCR法不僅僅局限于分子生物學(xué)，還因其簡便、迅速等特點被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)、食品、環(huán)境衛(wèi)生檢驗、動植物檢驗等其它領(lǐng)域。Taq DNA聚合酶是PCR法普遍使用的聚合酶，但其具有如下局限性。

1. 可信度 (Fidelity)：通常Taq DNA Polymerase的Fidelity并不高，PCR反應(yīng)有時會出現(xiàn)錯配 (Misincorporation) 現(xiàn)象，因而PCR克1隆、變異導(dǎo)入等實驗中，需加以注意。

2. 擴增的DNA長度：使用Taq DNA Polymerase進行PCR擴增時，通?？蓴U增幾kb的DNA，超過10 kb則比較困難。這就給利用PCR進行Mapping等Genome解析帶來麻煩。

3. 擴增量：使用Taq DNA Polymerase進行PCR產(chǎn)物克1隆及食品、環(huán)境衛(wèi)生檢驗等時，擴增量常常達不到要求。為解決以上難題，Takara在對Polymerase、Buffer及反應(yīng)條件等進行深入研究的基礎(chǔ)上，開發(fā)了LA PCR (Long and Accurate PCR) 技術(shù)，運用此技術(shù)可大量正確地擴增長達40 kb 的DNA部分片段。LA PCR技術(shù)擴展了PCR的應(yīng)用范圍，可在Genome解析、基因診斷、長片段 DNA的克1隆及變異導(dǎo)入等方面發(fā)揮優(yōu)勢。

出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。

靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

梯度PCR儀

把一次性PCR擴增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件（溫度梯度），通常12鐘溫度梯度，這樣的儀器就叫梯度PCR儀。

工作模式和原理同普通PCR儀一樣，它出了又普通PCR儀的功能外還多了一個梯度退火功能。DNA部分片段的擴增對溫度的控制精度要求特別高，不同的DNA部分片段其退火溫度不一樣，通過計算DNA部分片段中的CG堿基的含量只能初步的判斷出zui優(yōu)退火溫度在 5℃范圍內(nèi)，如果用普通PCR儀進行研究，需重復(fù)擴增很多次，然后做電泳進行分析來確定zui優(yōu)退火溫度。而梯度PCR儀則只需要一次就可以完成，在節(jié)省了時間的同時提高了實驗的可靠性和準確性。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴增，這樣節(jié)約成本的同時也節(jié)約了時間和經(jīng)費。在不設(shè)置梯度的情況下，梯度PCR儀也可以做普通PCR擴增。

該儀器主要應(yīng)用于科研，教學(xué)機構(gòu)，醫(yī)學(xué)臨床研究，高等院校，病毒分析，疾控中心等。