陽性對照和陰性對照的體外GTPγS/ GDP蛋白質(zhì)上樣量

注意：體內(nèi)細(xì)胞刺激將激l活可用Arf 6的大約10％，而體外GTPγS蛋白負(fù)載將激l活A(yù)rf 6的將近90％。

1，將0.5 ml每種細(xì)胞提取物等分到兩個(gè)微量離心管中（或使用1 μg純化的Arf 6蛋白）。

2，向每個(gè)試管中加入20 μl 0.5 M EDTA（終濃度為20 mM）。

3，將5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，終濃度）加到一個(gè)試管中（陽性對照）。

4，在第二個(gè)試管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，終濃度）（陰性對照）。

5，在攪拌下將試管在30°C孵育30分鐘。

6，通過將試管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM，終濃度）來停止加載。

紐斯特生物技術(shù)有限公司推出的Cdc42活性檢測試劑盒主要是依據(jù)單克l隆抗l體能夠特異性的識(shí)別Cdc42-GTP結(jié)合蛋白，而不識(shí)別Cdc42-GDP結(jié)合蛋白，進(jìn)而簡單并且快速的進(jìn)行Cdc42的活性檢測。同時(shí)試劑盒中的Cdc42-GTP單克l隆抗l體也可以進(jìn)行免l疫組化實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞和組織中Cdc42的活性監(jiān)測。每套試劑盒可以進(jìn)行20次檢測。

檢測原理

    武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的Cdc42活性檢測試劑盒主要是利用識(shí)別蛋白特異形態(tài)的Cdc42-GTP單克l隆抗l體特異性的去檢測細(xì)胞提取物或者體外的（樣品需要進(jìn)行GTPγS活化處理）活性Cdc42-GTP的水平。簡言之，特異性識(shí)別Cdc42活化構(gòu)象的鼠單克l隆抗l體可以特異性結(jié)合細(xì)胞裂解液中的Cdc42-GTP活性蛋白，然后利用protein A/G將抗原抗l體的結(jié)合物吸附下來，再利用特異性識(shí)別Cdc42活化構(gòu)象的兔多克l隆抗l體進(jìn)行免l疫印跡分析進(jìn)行檢測。

試劑制備

1X Assay/Lysis Buffer：實(shí)驗(yàn)前用去離子水將5X的Assay/Lysis緩沖液稀釋成1X的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制l劑如1 mM PMSF, 10 μg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 μg/mL aprotinin（抑肽酶）。

樣品處理

貼壁細(xì)胞

1. 培養(yǎng)細(xì)胞密度達(dá)到大約80%-90%之間（直徑10 cm培養(yǎng)皿，~107個(gè)細(xì)胞），并用活性劑或抑制l劑進(jìn)行處理。

2. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的PBS洗滌兩次。

3. 向細(xì)胞中加入1X Assay/Lysis緩沖液（每個(gè)直徑10cm的組織培養(yǎng)皿中加入0.5-1mL）。

4. 將培養(yǎng)皿放置于冰上處理10-20分鐘。

5. 用細(xì)胞刮棒把細(xì)胞從培養(yǎng)皿下分離下來。

6. 將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發(fā)生裂解，細(xì)胞裂解物可能會(huì)變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時(shí)，將細(xì)胞裂解物用27?的注射l器針頭來回吸取3-4次，以破壞基因組DNA，從而避免上述情況的出現(xiàn)。

8. 4°C 12000 g, 離心10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C條件下。