出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。

引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。

靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。

低嚴(yán)格單鏈特異性引物PCR (Lowstringencysingle specific primer PCR, LSSP- PGR)技術(shù)

LSSP - PCR是建立在PCR基礎(chǔ)上的又一種新型基因突變檢測(cè)技術(shù)。要求是“二高一低”。高濃度的單鏈引物( 5-端/ 3-端引物均可).約4. 8Lmol高濃度的Taq酶( 16Lmol/ 100ml) 低退火溫度( 300.所用的模板必須是純化的DNA部分片段。在這種低嚴(yán)格條件下。引物與模板間發(fā)生不同程度的錯(cuò)配。形成多種大小不同的擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)電泳分離后形成不同的帶型。對(duì)同一目的基因而言。所形成的帶型是固定的。因而稱之為“基因標(biāo)簽”。這是一種檢測(cè)基因突變或進(jìn)行遺傳鑒定的快速敏感方法。

PCR有哪些應(yīng)用領(lǐng)域？

基因表達(dá)

通常可通過(guò)PCR來(lái)檢測(cè)不同細(xì)胞類型、組織和生物體在特定時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)差異。首先，從目標(biāo)樣品中分離出RNA并將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后，通過(guò)由PCR擴(kuò)增的cDNA數(shù)量，確定mRNA的初始水平。這一過(guò)程也被稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR。

終點(diǎn)PCR 可通過(guò)凝膠里的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶強(qiáng)度對(duì)RNA的表達(dá)進(jìn)行定量（一種半定量方法）。例如，對(duì)起始cDNA進(jìn)行連續(xù)稀釋并擴(kuò)增。通過(guò)凝膠電泳使不同起始量的終點(diǎn)PCR得率可視化，然后對(duì)條帶強(qiáng)度進(jìn)行定量，并以管家基因?yàn)閰⒄者M(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，預(yù)估擴(kuò)增靶點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)水平。如今，終點(diǎn)PCR已基本被實(shí)時(shí)PCR 或qPCR 取代了，因?yàn)樗鼈兛色@得更可靠和更準(zhǔn)確的基因表達(dá)定量結(jié)果。