核酸試劑盒

核酸檢測(cè)試劑盒為什么會(huì)出現(xiàn)漏檢？

大家在新聞上看到過核酸檢測(cè)出現(xiàn)漏檢的現(xiàn)象，這是為什么呢？首先，我們對(duì)病毒認(rèn)識(shí)不足，疾病進(jìn)展目前都不清楚，這就可能導(dǎo)致采樣時(shí)間不合適，從而漏檢。第二，每個(gè)人的抵抗力不同，同樣都有了病毒，但有的人能快速地清除病毒，體內(nèi)病毒量少，自然不易檢出。第三，試劑盒有自身的靈敏度限制，也就是說樣本中的病毒量少到一定程度，試劑盒是檢測(cè)不出來的，這是核酸檢測(cè)技術(shù)上的限制，另外，樣本采集是否規(guī)范、轉(zhuǎn)運(yùn)保存是否恰當(dāng)?shù)纫蛩囟紩?huì)影響試劑盒的陽(yáng)性檢出率。

RPA技術(shù)主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，反應(yīng)溫度在37°C左右。

重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會(huì)發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動(dòng)DNA合成，對(duì)模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合，防止進(jìn)一步替換。在這個(gè)體系中，由兩個(gè)相對(duì)的引物起始一個(gè)合成事件。整個(gè)過程進(jìn)行得非?？?/span>，一般可在十分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物。RPA擴(kuò)增的基礎(chǔ)體系(TwistAmp? Basic)含有DNA擴(kuò)增所需的所有試劑，我們只要準(zhǔn)備好引物和模板就行。擴(kuò)增結(jié)果可以通過凝膠電泳進(jìn)行終點(diǎn)檢測(cè)，產(chǎn)物純化后可用于下游研究。

在這個(gè)基礎(chǔ)體系中添入不同的酶和探針，就可以實(shí)現(xiàn)多樣化的RPA應(yīng)用。舉例來說，TwistAmp? exo結(jié)合了exo探針技術(shù)和核酸外切酶III，能實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的實(shí)時(shí)讀取，就像熒光定量PCR一樣。不過反應(yīng)終點(diǎn)的擴(kuò)增子總量有所減少，適合獲得強(qiáng)熒光信號(hào)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，不適合終點(diǎn)檢測(cè)(比如跑膠)。將exo探針技術(shù)、核酸外切酶III和逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合起來，可以一步實(shí)現(xiàn)RNA模板的實(shí)時(shí)擴(kuò)增。

等溫核酸試劑盒

目前，核酸檢測(cè)方法主要包括PCR法、恒溫?cái)U(kuò)增法、測(cè)序法、CRISPR檢測(cè)法等。其中，第二代PCR技術(shù)是病毒檢測(cè)方法的主流方法，也是目前認(rèn)可的SARS-CoV-2測(cè)定方法。第二代PCR技術(shù)，又稱熒光PCR法，是指在反應(yīng)體系中加入了熒光物質(zhì)，通過專門儀器實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，并對(duì)模板進(jìn)行定量計(jì)算。為了增加靈敏度和特異性，熒光PCR法出現(xiàn)了不少改進(jìn)版本，包括Taqman探針法、雙重或多重?zé)晒釶CR等。