分子實驗介紹——熒光定量PCR檢測

熒光定量PCR是檢測生物樣品中RNA含量的普遍的方法，通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標(biāo)記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。目前主要使用Sybr green和taqman法對RNA含量進行檢測。Sybr green在低樣本量時成本較低，目前選用的較多。

SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料。當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內(nèi)，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過程是：1、開始反應(yīng)，當(dāng)SYBR Green染料與DNA雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光。2、DNA變性時，SYBR Green染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。

實驗流程：細胞或組織RNA提取-RNA濃度檢測-RNA逆轉(zhuǎn)錄-定量PCR檢測。

結(jié)果示例：

圖 A 基因擴增曲線圖；B 基因擴增溶解曲線圖；C mRNA相對表達量變化

從圖中可以擴增曲線可以看出目的RNA擴增效果，溶解曲線可以看出引物識別特異性情況，通過使用ΔΔCt方法計算可以得到每個組中目的mRNA表達變化。

免yi共沉淀（Co-IP檢測）是以抗ti和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的方法。當(dāng)細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用也被保留下來。用預(yù)先固化在beads上的蛋白質(zhì)A的抗ti免yi沉淀A蛋白，那么與A蛋白在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)B也能一起沉淀下來，再通過蛋白變性分離，對B蛋白進行檢測，進而證明兩者間的相互作用。

腺相關(guān)病毒包裝原理

腺相關(guān)病毒( adeno-associated virus, AAV)是一類細小病毒, 基銦組為單鏈DNA ,對分裂細胞和非分裂細胞均具有g(shù)an染能力。通常需要腺病毒或皰zhen病毒幫助其在體內(nèi)fu制擴增。重組腺相關(guān)病毒( recombinant AAV, rAAV )是利用AAV2型基因組與不同xue清型的衣殼蛋白基因組結(jié)合產(chǎn)生的混合體病毒載體,可將目的基因的CDS區(qū)序列或者RNAi干擾序列插入rAAV表達質(zhì)粒中,包裝病毒后gan染細胞完成對目的基因的操作。腺相關(guān)病毒具有g(shù)an染溫和,免yi原性小,長效穩(wěn)定表達的特點,主要應(yīng)用于動物體內(nèi)注射。源井生物提供的腺相關(guān)病毒顆粒經(jīng)過超su離心純化,并通過qPCR對病毒基因拷貝進行滴定。腺相關(guān)病毒的滴度在10^12~10^13GC/ml ,可以滿足各類整體實驗的使用要求。

STR檢測

短串聯(lián)重復(fù)(Short tandem repeats, STR)，又稱微wei星DNA(Microsatellite DNA)或簡單重復(fù)序列(Simple repeat sequence, SRS或SSR)，是廣泛存在于原核生物和真核生物基因組中的核苷酸重復(fù)序列。有絲分裂過程中DNA鏈之間的錯配引起的fu制滑動被認(rèn)為是導(dǎo)致STR產(chǎn)生的較為常見原因，并且依據(jù)不同fu制單元大小的不同以及不同物種之間，fu制滑動發(fā)生的概率也不相同。

STR是以核心序列 (core repeat units) 首尾相連多次重復(fù)形成。每個STR的核心序列結(jié)構(gòu)相同，長度為2-6bp，但其重復(fù)單位數(shù)目和重復(fù)區(qū)域的長度不同，因此STR在不同種族、不同人群之間的分布具有差異性，構(gòu)成了STR遺傳多態(tài)性。不同個體之間在一個同源STR位點的重復(fù)次數(shù)也不同，因而同指紋識別一樣，STR位點分析也可對個體進行身份識別。通過識別個體基因組在特定位點的特定序列重復(fù)，即可創(chuàng)建其基因檔案。基于此，STR分析法已經(jīng)成為一種重要的鑒定分析方法，應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)、qin子鑒定及細胞鑒定等領(lǐng)域。