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生豬屠宰場(chǎng)熒光定量PCR服務(wù)介紹「多圖」

發(fā)布時(shí)間:2021-07-07 04:57  

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熒光定量PCR技術(shù)產(chǎn)生并成熟于上世紀(jì)90年代,由于該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,能夠?qū)CR反應(yīng)的全過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控,并且自動(dòng)化程度高,所以該技術(shù)從產(chǎn)生到現(xiàn)在短短的十幾年時(shí)間,在科研及檢驗(yàn)領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用,成為分子生物學(xué)領(lǐng)域不可或缺的一項(xiàng)重要技術(shù)。在real-timeQ-PCR中,對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)和連續(xù)地分析擴(kuò)增相關(guān)的熒光信號(hào),隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行,監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)的變化可以繪制成一條曲線。熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)隨著PCR反應(yīng)的積累來實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR反應(yīng)的進(jìn)程,并通過分析軟件對(duì)PCR的反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)分析的技術(shù)。系統(tǒng)組成:定量PCR儀、電腦、分析軟件、試劑及耗材。

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進(jìn)行熒光定量PCR體系的配制時(shí)i好在冰上進(jìn)行,操作環(huán)境不用非得在超凈臺(tái)中進(jìn)行,環(huán)境安靜整潔都可以。因?yàn)槊恳粋€(gè)梯度要做三個(gè)重復(fù),因此先在1ml的無菌離心管中配制好后再分裝入96孔板中。研究表明熱工過程可以殺滅病毒(如流行性腹瀉病毒),但這只能作為緊急緩解措施,因?yàn)檫@要求產(chǎn)品在干燥和運(yùn)輸過程中必須不存在交叉污染。實(shí)驗(yàn)中我使用過熒光定量八聯(lián)管和96孔板,個(gè)人推薦96孔板。因?yàn)榘寺?lián)管你需要蓋上蓋子,而且蓋子比較的難按下去,稍不慎就把八聯(lián)管弄斷或者液體撒出來。有的時(shí)候一下忘記了是從哪邊開始的。96孔板比較方便,加完樣品后只需附上一層膜,用它自帶的板子撫平即可。上機(jī)器前i好離心一下,讓貼在管壁上的液體流下來同時(shí)也消掉氣泡。


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QF-PCR技術(shù)在國(guó)外已有較廣泛的應(yīng)用,但目前尚未在國(guó)內(nèi)產(chǎn)前診斷臨床中普遍開展。豬場(chǎng)一線需要快速檢測(cè)技術(shù)以盡早確診,做到早處理、早隔離,但要明確的是,豬場(chǎng)只需要通過合適的檢測(cè)工具,幫助“定性”即可,不需要深入定量分析,有問題直接捕殺無害化處理。為規(guī)范使用QF-PCR技術(shù),由國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委i員會(huì)召集、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心主辦的"全國(guó)產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)管理規(guī)范編制研討會(huì)"于2015年11月14日在成都召開,會(huì)議就QF-PCR等快速產(chǎn)前診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用進(jìn)展及其在國(guó)內(nèi)應(yīng)用中存在的具體問題進(jìn)行了深入而廣泛的探討,并形成了QF-PCR技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用共識(shí)。

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熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國(guó)PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。主要是利用磁珠純化核酸及蛋白質(zhì)從而達(dá)到提取核酸的目的,在細(xì)胞、動(dòng)植物組織等研究方面,一個(gè)樣品用一個(gè)探針,有效防止樣品之間的交叉污染。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理: 隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì),熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán),收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào),這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè) 產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。 


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定量PCR已經(jīng)從基于凝膠的低通量分析發(fā)展到高通量的熒光分析技術(shù),即實(shí)時(shí)定量PCR。因?yàn)榘寺?lián)管你需要蓋上蓋子,而且蓋子比較的難按下去,稍不慎就把八聯(lián)管弄斷或者液體撒出來。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出,由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。實(shí)時(shí)定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來即時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量,并據(jù)此推斷目的基因的初始量,不需要取出PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。

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PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。96孔板比較方便,加完樣品后只需附上一層膜,用它自帶的板子撫平即可。探針完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時(shí),Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步.