分子實(shí)驗(yàn)介紹——印跡（Western blot）檢測(cè)

通過(guò)SDS-PAGE凝膠將細(xì)胞或生物樣品內(nèi)的蛋白按照蛋白分子量從大到小規(guī)律分離開(kāi)。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如纖維素薄膜或PVDF膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的起反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二起反應(yīng)（目前主要用HRP標(biāo)記的第二），經(jīng)過(guò)底物顯色或自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分（目前主要使用魯米諾和二抗中的HRP反應(yīng)發(fā)出熒光，通過(guò)儀器或者膠片顯色）。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。5、滴度檢測(cè):細(xì)胞為30%－50％時(shí)加入病毒上清液，檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞比例。

實(shí)驗(yàn)流程：細(xì)胞收集-細(xì)胞裂解，蛋白提取-蛋白變性-SDS-PAGE電泳-蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜印記-蛋白封閉-目的孵育-二抗孵育-顯色拍照

結(jié)果示例：

圖 A不同大小的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，Western blot檢測(cè)圖片；B A蛋白不同培養(yǎng)時(shí)間后Western blot檢測(cè)圖片；C 使用Image pro plus軟件對(duì)A蛋白灰度檢測(cè)，A蛋白表達(dá)變化統(tǒng)計(jì)圖

  全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序    

全轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細(xì)胞在特定狀態(tài)下所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的總和，包括mRNA和各種noncoding RNA。我們知道生物體本身的轉(zhuǎn)錄過(guò)程是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化且十分復(fù)雜的分子作用網(wǎng)絡(luò)，如果只是對(duì)某個(gè)單一RNA分子的研究，有時(shí)并不能準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)分子作用機(jī)制。而競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)理論闡述了一種全新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式：ceRNA（包括lncRNA、circRNA、mRNA、假基因等）分子能夠通過(guò)miRNA應(yīng)答元件（microRNA Respe Element, MRE）競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合相同的miRNA來(lái)調(diào)節(jié)彼此的表達(dá)水平。舉個(gè)例子：miRNA會(huì)導(dǎo)致基因沉默現(xiàn)象發(fā)生，而如果lncRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合了miRNA，從而影響了miRNA基因沉默功能實(shí)現(xiàn)。腺相關(guān)病毒具有g(shù)an染溫和,免yi原性小,長(zhǎng)效穩(wěn)定表達(dá)的特點(diǎn),主要應(yīng)用于動(dòng)物體內(nèi)注射。

      ceRNA是目前轉(zhuǎn)錄調(diào)控領(lǐng)域的熱點(diǎn)內(nèi)容之一，通過(guò)全轉(zhuǎn)錄組研究能夠系統(tǒng)性的闡述ceRNA的分子作用機(jī)制。目前對(duì)全轉(zhuǎn)錄組簡(jiǎn)便的方法就是構(gòu)建2個(gè)測(cè)序文庫(kù)分別進(jìn)行測(cè)序。標(biāo)準(zhǔn)的生物信息學(xué)分析能夠得到mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA各自的研究?jī)?nèi)容，靶向調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、ceRNA網(wǎng)絡(luò)、共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析可以將這幾種RNA聯(lián)合起來(lái)分析，從而發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型。去除rRNA的鏈特異性文庫(kù)，含有的RNA信息含量十分豐富，通過(guò)測(cè)序和生物信息學(xué)分析能夠得到mRNA、lncRNA、circRNA的鑒定及注釋信息。不過(guò)該文庫(kù)構(gòu)建時(shí)會(huì)進(jìn)行片段化選擇從而濾掉了small RNA的信息，所以需要另外再構(gòu)建一個(gè)small RNA文庫(kù)，進(jìn)行測(cè)序分析后可以得到miRNA和其他small RNA的鑒定及注釋信息。腺相關(guān)病毒包裝原理腺相關(guān)病毒(adeno-associatedvirus,AAV)是一類(lèi)細(xì)小病毒,基銦組為單鏈DNA,對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有g(shù)an染能力。全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方案路線圖如下所示：

蛋白質(zhì)雙向電泳實(shí)驗(yàn)流程

1.三氯yi酸-bing酮沉淀法提取蛋白

2.雙向電泳分離待測(cè)樣品

(1)一相等電聚焦前處理按照所用儀器的廠商提供操作手冊(cè)進(jìn)行。蛋白質(zhì)上樣濃度不要超過(guò)10mg/mL,否則會(huì)造成蛋白質(zhì)的聚集或沉淀。

(2)等電聚焦完畢后(約需24hr），若不立即進(jìn)行第二相電泳，膠條可夾在兩層塑料薄膜中于-70℃保存數(shù)月。

(3)等電聚焦好的膠條按廠商提供的操作手冊(cè)平衡兩次。平衡完畢后，于電泳儀上用12.5%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離。儀器設(shè)置為2.5W/膠 45min，15W/膠 5-8hr，20℃。

3.銀染法對(duì)凝膠進(jìn)行染色

(1)固定(2)清洗(3)增敏(4)清洗(5)染色(6)清洗(7)顯影(8)定影(9)水洗

3.凝膠掃描及圖像分析

(1)圖像掃描：凝膠染色后采用Image scanner以300dpi，16-bit模式（65536灰階）進(jìn)行掃描。

(2)圖像分析：掃描完畢后，凝膠繼續(xù)置于1%yi酸中于4℃保存。掃描后的圖像用ImageMaster 2D Platinum software軟件進(jìn)行分析。由于ChIP采用甲醛固定活l細(xì)胞或者組織的方法，因此能比較真實(shí)的反映細(xì)胞內(nèi)TF與Promoter的結(jié)合情況，還可以用來(lái)研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。分析按照軟件廠商提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以zui小點(diǎn)面積30，平滑度2為主要參數(shù)zui大限度檢測(cè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。以目標(biāo)蛋白質(zhì)3個(gè)重復(fù)具有相同趨勢(shì)，目標(biāo)蛋白質(zhì)相鄰位點(diǎn)的相對(duì)一致性，至少2個(gè)重復(fù)有2倍以上差異作為判定差異表達(dá)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)。