外顯子測序

外顯子組測序（exome-seq）是對定向富集的基因組DNA進行高通量測序，它能夠以相對低的費用對人類外顯子組進行拷問。2009年，外顯子組捕獲工具的出現(xiàn)，讓外顯子組測序這種技術(shù)迅速紅起來。到目前為止，已有超過1萬個外顯子組被測序。

如今有多家公司推出了外顯子組捕獲試劑，包括羅氏NimbleGen、安捷倫、Illumina，還有現(xiàn)在的華大基因。這些方法究竟孰優(yōu)孰劣，斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)系的研究人員對市場上三個主流的外顯子組測序平臺進行了比較。該研究結(jié)果發(fā)表在《Nature Biotechnology》上。研究人員利用安捷倫、Illumina和NimbleGen的外顯子組測序平臺對同一個人類血液樣品進行分析。他們的結(jié) 果表明，NimbleGen平臺作為一個使用高密度重疊探針的平臺，盡管覆蓋了較少的基因組區(qū)域，但在靈敏檢測小的變異時所需的測序量也少。分子組技術(shù)人員畢業(yè)于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院、浙江理工大學(xué)等高校生物醫(yī)學(xué)相關(guān)專業(yè)，全部具有碩士研究生以上學(xué)歷，熟練掌握分子生物學(xué)相關(guān)實驗，可開展多種分子生物學(xué)檢測服務(wù)。在同樣獲得80M測序數(shù)據(jù)的情況下，NimbleGen有97%的目標序列達到10x以上的測序深度，而其他產(chǎn)品只有90%。而安捷倫和Illumina的探針能夠在低密度下捕獲更多數(shù)量的變異。此外，Illumina還捕獲了未翻譯的區(qū)域，這是NimbleGen和安捷倫平臺無法靶定的。研究人員還比較了同一樣品的外顯子組測序和全基因組測序（WGS），顯示外顯子組測序能夠檢測到WGS錯過的小變異。

除了文中提到了三個主流平臺，外顯子組捕獲方面的新產(chǎn)品也在不斷推出，研究人員的選擇也將更廣泛。羅氏NimbleGen即將推出新一代的外顯子液相捕獲產(chǎn)品。若miRNA與mRNA的結(jié)合位點不配對，則抑制mRNA的翻譯。這一新產(chǎn)品將可捕獲64M的基因組序列，包括外顯子以及miRNA，它含與其他NimbleGen液相捕獲產(chǎn)品相同的2.1M高密度探針，以高xiao、均一、特異、的定向捕獲。

基因組甲l基化水平(Methyl ati on Content)的分析:

1.高l效液相色譜(Hi gh-performanceLi qui dChromatography, HPLC)HPLC是- -種比較傳統(tǒng)的方法,是根據(jù)DNA或蛋白分子量和構(gòu)象的不同而使其加以分離。由于在動態(tài)相和靜態(tài)相下分子的光吸收度并不相同而加以定量。隨著系統(tǒng)的壓強的增加，其分辨率增l高。故而能夠定量測定基因組整體水平DNA甲l基化水平。lncRNA和mRNA同時檢測：芯片上包含有的lncRNA和新的mRNA序列檢測探針。該方法由Ruo等1980年首l次報道。過程是將DNA樣品先經(jīng)鹽酸或氫l氟酸水解成堿基，水解產(chǎn)物通過色譜柱，結(jié)果與標準品比較，用紫外光測定吸收峰值及其量，計算5 mC/(5mC 5C)的積分面積就得到基因組整體的甲l基化水平。這是一種檢測DNA甲l基化水平的標準方法。

2.高l效毛細管電泳法(Hi gh-per formance Capillary Electrophoresis, HPCE)這是一-種利用窄孔熔融石英毛細管來從復(fù)合物中分離不同化學(xué)組分的技術(shù)。其基礎(chǔ)是在強電場下不同分子的由于其所帶電荷，大小，結(jié)構(gòu)以及疏水性等不同而相互分開。(一)國家標準:國家標準采用三步法，即:乳糖發(fā)酵試驗、分離培養(yǎng)和證實試驗。用HIPCE方法處理DNA水解產(chǎn)物來確定5mC水平，簡便，經(jīng)濟且敏感性高。

18.引物是經(jīng)過PAGE純化的，為什么還有堿基缺失或插入？

答：理論上分析型PAGE變性電泳，可以區(qū)分引物之間一個堿基的差別。但是制備PAGE電泳，上樣量都是非常大，電泳時的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，分辨率已下降，電泳后割帶回收目的引物時，很難說不割到差別僅幾個堿基的引物。國內(nèi)有一個不好的現(xiàn)象，PAGE純化的引物，特別是長引物要的量都比較高，導(dǎo)致割的條帶有時可能比較寬。往每個EP管中加入250ul，劇烈震蕩30s，冰上靜置12min[問l。建議：您如果減少OD數(shù)，引物遇到的問題可能就會少一些。

19. TaqMan 探針設(shè)計的基本原則是什么？

答：下列原則供您參考。

◆TaqMan 探針位置盡可能靠近擴增引物（擴增產(chǎn)物50-150bp），但不能與引物重疊。

◆長度一般為18-40mer 。

◆G-C含量控制在40-80%左右。

◆避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。

◆在引物的5'端避免使用G。

◆選用比較多的堿基C。

◆退火溫度Tm控制在 68-70C   左右。

有用的熒光染料參數(shù)