PCR的創(chuàng)建

Khorana (1971)等zui早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可合成tRNA基因?！钡捎诋?dāng)時基因序列分析方法尚未成熟，熱穩(wěn)定DNA聚合酶尚未報道以及引物合成的困難，這種想法似乎沒有實際意義。加上分子克1隆技術(shù)的出現(xiàn)提供了一種克1隆和擴(kuò)增基因的途徑，所以Khorana的設(shè)想被人們遺忘了。

1983年4月的一個星期五晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上,猛然閃現(xiàn)出“多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”的想法。

1983年12月，Mullis用同位素標(biāo)記法看到了10個循環(huán)后的49 bp長度的第yi個PCR片段；

1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。Mullis要合成DNA引物來進(jìn)行測序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。

1985年10月25日申請了PCR的專1利，

1987年7月28日批準(zhǔn)（專1利號4,683,202 ），Mullis是第yi個發(fā)明人；

1985年12月20日在Science雜志上發(fā)表了第yi篇PCR的學(xué)術(shù)論1文，Mullis是共同作者；

1986年5月，Mullis在冷泉港實驗室做專題報告，全世界從此開始學(xué)習(xí)PCR的方法。

Hot Start PCR的原理

Hot Start PCR法是提高PCR特異性的重要方法之一。這種方法可以防止在PCR反應(yīng)第yi步驟因引物的錯配或引物二聚體的形成而導(dǎo)致的非特異性擴(kuò)增，從而可以提高目的DNA部分片段的擴(kuò)增效率。TaKaRa Taq Hot Start Version，TaKaRa Ex Taq Hot Start Version，TaKaRa LA Taq Hot Start Version，PrimeSTAR HS DNA polymerase，MightyAmp DNA Polymerase是抗1體和DNA聚合酶的混合制品?？?體在高溫加熱前與聚合酶相結(jié)合，抑制聚合酶的活性。在PCR反應(yīng)zui初的DNA變性步驟，抗1體變性，聚合酶活性恢復(fù)。

 PCR技術(shù)的基本原理

PCR技術(shù)是在模板DNA、引物和四種dNTP等存在的條件下.依賴于DNA聚合酶(T aq酶)的酶.促合成反應(yīng)。其具體反應(yīng)分三步:變性、退火、聚合。以上三步為一個循環(huán)，每一 循環(huán)的產(chǎn)物DNA又可以作為下一個循環(huán)模板,數(shù)小時后，介于兩個引物之間的目的DNA得到了大量的copy，經(jīng)25~ 30次循環(huán)DNA數(shù)量可達(dá)2x1067拷貝數(shù)。

錨定PCR(Anchored PCR. APCR技術(shù).

用酶法在一通用引物反轉(zhuǎn)錄cDNA3"-末端加上一段已知序列，然后以此序列為引物結(jié)合位點(diǎn)對該cDNA進(jìn)行擴(kuò)增,稱為APCR.應(yīng)用:它可用于擴(kuò)增未知或全知序列，如未知cDNA的制備及低豐度cDNA文庫的構(gòu)建。

差示PCR (differential PCR, d -PCR)技術(shù)

d-PCR可以定量檢測標(biāo)本靶基因的拷貝數(shù)。它是將目的基因和一個單拷貝的參照基因置于一個試管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳分離后呈兩條區(qū)帶,比較兩條區(qū)帶的豐度，或在引物5°-端標(biāo)記上放1射性核素后.通過檢測兩條區(qū)帶放1射性強(qiáng)度即可測出目的基因的拷貝數(shù)。

定量PCR(quantitative PCR, qPCR)技術(shù)

qPCR技術(shù)是用合成的RNA作為內(nèi)標(biāo)來檢測PCR擴(kuò)增目的mRNA的量,涉及目的mRNA和內(nèi)標(biāo)用相同的引物共同擴(kuò)增.但擴(kuò)增出不同大小片段的產(chǎn)物.可容易地電泳分離。一種內(nèi)標(biāo)可用于定量多種不同目的mRNA。qPCR可用 于研究基因表達(dá)。能提供特定DNA基因表達(dá)水平的變化.在癌1癥、代謝紊亂及自身免1疫性疾病的診斷和分析中很有價值。