分子實驗介紹——印跡（Western blot）檢測

通過SDS-PAGE凝膠將細胞或生物樣品內的蛋白按照蛋白分子量從大到小規(guī)律分離開。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如纖維素薄膜或PVDF膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的起反應，再與酶或同位素標記的第二起反應（目前主要用HRP標記的第二），經過底物顯色或自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分（目前主要使用魯米諾和二抗中的HRP反應發(fā)出熒光，通過儀器或者膠片顯色）。該技術廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。5、滴度檢測:細胞為30%－50％時加入病毒上清液，檢測陽性細胞比例。

實驗流程：細胞收集-細胞裂解，蛋白提取-蛋白變性-SDS-PAGE電泳-蛋白質轉膜印記-蛋白封閉-目的孵育-二抗孵育-顯色拍照

結果示例：

圖 A不同大小的質粒轉染細胞后，Western blot檢測圖片；B A蛋白不同培養(yǎng)時間后Western blot檢測圖片；C 使用Image pro plus軟件對A蛋白灰度檢測，A蛋白表達變化統(tǒng)計圖

  全轉錄組測序    

全轉錄組是指特定組織或細胞在特定狀態(tài)下所有轉錄產物的總和，包括mRNA和各種noncoding RNA。我們知道生物體本身的轉錄過程是一個動態(tài)變化且十分復雜的分子作用網絡，如果只是對某個單一RNA分子的研究，有時并不能準確的發(fā)現(xiàn)分子作用機制。而競爭性內源RNA(ceRNA)理論闡述了一種全新的轉錄調控模式：ceRNA（包括lncRNA、circRNA、mRNA、假基因等）分子能夠通過miRNA應答元件（microRNA Respe Element, MRE）競爭性地結合相同的miRNA來調節(jié)彼此的表達水平。舉個例子：miRNA會導致基因沉默現(xiàn)象發(fā)生，而如果lncRNA競爭性結合了miRNA，從而影響了miRNA基因沉默功能實現(xiàn)。腺相關病毒具有gan染溫和,免yi原性小,長效穩(wěn)定表達的特點,主要應用于動物體內注射。

      ceRNA是目前轉錄調控領域的熱點內容之一，通過全轉錄組研究能夠系統(tǒng)性的闡述ceRNA的分子作用機制。目前對全轉錄組簡便的方法就是構建2個測序文庫分別進行測序。標準的生物信息學分析能夠得到mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA各自的研究內容，靶向調控網絡、ceRNA網絡、共表達網絡分析可以將這幾種RNA聯(lián)合起來分析，從而發(fā)現(xiàn)新的調控網絡模型。去除rRNA的鏈特異性文庫，含有的RNA信息含量十分豐富，通過測序和生物信息學分析能夠得到mRNA、lncRNA、circRNA的鑒定及注釋信息。不過該文庫構建時會進行片段化選擇從而濾掉了small RNA的信息，所以需要另外再構建一個small RNA文庫，進行測序分析后可以得到miRNA和其他small RNA的鑒定及注釋信息。腺相關病毒包裝原理腺相關病毒(adeno-associatedvirus,AAV)是一類細小病毒,基銦組為單鏈DNA,對分裂細胞和非分裂細胞均具有gan染能力。全轉錄組測序方案路線圖如下所示：

蛋白質雙向電泳實驗流程

1.三氯yi酸-bing酮沉淀法提取蛋白

2.雙向電泳分離待測樣品

(1)一相等電聚焦前處理按照所用儀器的廠商提供操作手冊進行。蛋白質上樣濃度不要超過10mg/mL,否則會造成蛋白質的聚集或沉淀。

(2)等電聚焦完畢后(約需24hr），若不立即進行第二相電泳，膠條可夾在兩層塑料薄膜中于-70℃保存數(shù)月。

(3)等電聚焦好的膠條按廠商提供的操作手冊平衡兩次。平衡完畢后，于電泳儀上用12.5%SDS-PAGE凝膠進行電泳分離。儀器設置為2.5W/膠 45min，15W/膠 5-8hr，20℃。

3.銀染法對凝膠進行染色

(1)固定(2)清洗(3)增敏(4)清洗(5)染色(6)清洗(7)顯影(8)定影(9)水洗

3.凝膠掃描及圖像分析

(1)圖像掃描：凝膠染色后采用Image scanner以300dpi，16-bit模式（65536灰階）進行掃描。

(2)圖像分析：掃描完畢后，凝膠繼續(xù)置于1%yi酸中于4℃保存。掃描后的圖像用ImageMaster 2D Platinum software軟件進行分析。由于ChIP采用甲醛固定活l細胞或者組織的方法，因此能比較真實的反映細胞內TF與Promoter的結合情況，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系。分析按照軟件廠商提供的說明書進行。以zui小點面積30，平滑度2為主要參數(shù)zui大限度檢測蛋白質點。以目標蛋白質3個重復具有相同趨勢，目標蛋白質相鄰位點的相對一致性，至少2個重復有2倍以上差異作為判定差異表達蛋白質的標準。