細胞實驗介紹——慢病毒建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系

慢病毒包裝：公司使用3質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)，慢病毒系統(tǒng)使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G，過表達慢病毒系統(tǒng)使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三質(zhì)粒系統(tǒng)，將質(zhì)?；靹蚝笫褂昧姿徕}轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞中，培養(yǎng)48h后，收集上清。置于37目，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周，計數(shù)含50個細胞以上得克l隆，計算細胞集落形成率，Spotll采集圖像。使用genecopo公司慢病毒顆粒純化試劑盒將慢病毒純化。純化后留取部分檢測病毒滴度，其余病毒凍存于-80℃冰箱中。

滴度檢測：將病毒顆粒使用梯度稀釋，分別293T細胞，72h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達情況。根據(jù)細胞熒光量計算病毒滴度。

細胞：在病毒前一天對細胞進行計數(shù)，接種約10000個細胞于12孔板中，培養(yǎng)過夜后使用無培養(yǎng)基稀釋病毒，加入12孔板中對細胞進行，病毒數(shù)量根據(jù)推薦細胞的MOI加入（若無推薦MOI，需做病毒梯度：1,5,10,50,100 5個梯度對細胞），6h后去除含病毒溶液，加入完全培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光強度。Phagophore的特征為:新月狀或杯狀，雙層或多層膜,有包繞胞漿成分的趨勢。同時加入puromycin對細胞篩選，篩選約2周時間。細胞篩選好后，使用定量PCR和Western blot檢測目的基因的穩(wěn)定表達情況。

實驗流程：慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建-HEK293T細胞培養(yǎng)-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞-病毒收集-病毒純化-病毒滴度檢測-細胞-穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞篩選-穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞鑒定

結(jié)果示例：

                                               圖 A 病毒滴度檢測；B 目的細胞病毒效果圖

自噬(autophagy)是細胞受到刺激后吞噬自身的細胞質(zhì)或細胞器，終將吞食物在溶酶體內(nèi)降解的過程,自噬體(autophagosome)為雙層膜包被的圓形或橢圓形結(jié)構(gòu),內(nèi)含細胞質(zhì)、長壽蛋白質(zhì)和異常蛋白聚集物，損傷或多余細胞器如線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和微體、

病毒和細菌等。由于zhong瘤組織這種新生血管結(jié)構(gòu)及功能異常，且血管基質(zhì)不完善，這種微血管容易發(fā)生滲漏，因此腫liu細胞不需經(jīng)過復(fù)雜的侵襲過程而直接穿透到血管內(nèi)進入血流并在遠隔部位形成轉(zhuǎn)移。單丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine,MDC是一種熒光色素，是嗜酸性染色劑，通常被于檢測自噬體形成的特異性標記染色劑,其檢測激發(fā)濾光片波長355nm ,阻斷濾光片波長512nm。Leagene MDC染色液適用于培養(yǎng)細胞的自噬染色，可與EB合用雙染。

透射電鏡觀察自噬小體方法

利用光學顯微鏡，借助相應(yīng)的染色方法，可以觀察細胞凋亡時會出現(xiàn)的一系列形態(tài)特征。常用的染色法包括臺盼藍、橙 / 化乙啶（AO/EB）、Giemsa 和 HE 法等。在光學顯微鏡下可以觀察到核固縮、質(zhì)濃縮和凋亡小體等典型的凋亡現(xiàn)象。

電鏡形態(tài)學觀察法是一種比較經(jīng)典、可靠的方法，被認為是確定細胞凋亡的金標準。電鏡下凋亡細胞表現(xiàn)為染色質(zhì)凝集、核濃縮、核裂解、胞漿收縮和胞膜具有發(fā)泡現(xiàn)象及凋亡小體出現(xiàn)等。