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發(fā)布時(shí)間:2020-12-16 04:22  
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逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建及包裝
逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus)是一類RNA病毒。在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下,以病毒RNA為模板合成cDNA再通過(guò)DNA、轉(zhuǎn)錄、翻譯等過(guò)程形成病毒顆粒。逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種新的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng),由逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、輔助載體(表達(dá)病毒包裝需要的蛋白質(zhì))和包裝細(xì)胞系組成。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在外源基因表達(dá)、基因沉默、、生物制藥等得到廣泛的應(yīng)用。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體主要優(yōu)點(diǎn):轉(zhuǎn)染范圍廣,可以各種細(xì)胞類型,轉(zhuǎn)入的外源基因可完全融合,對(duì)細(xì)胞率高,細(xì)胞不產(chǎn)生病變,可建立細(xì)胞系長(zhǎng)期持續(xù)表達(dá)外源基因。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)共有兩部分組成:包裝細(xì)胞系和缺陷病毒本身。在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中,去除了正常的蛋白編碼序列而保留了和包裝信號(hào),通過(guò)分子技術(shù)將目的基因插入此載體上,而包裝細(xì)胞系能提供病毒載體包裝成病毒粒子所需的結(jié)構(gòu)蛋白。當(dāng)重組病毒載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞后,缺陷病毒載體和包裝細(xì)胞的互補(bǔ)作用共同完成病毒裝配,該病毒顆??善渌拗骷?xì)胞,此時(shí)目的基因進(jìn)入該細(xì)胞并整合到細(xì)胞基因組中,導(dǎo)致插入序列在宿主細(xì)胞中表達(dá),產(chǎn)生目的蛋白。宿主細(xì)胞不能像包裝細(xì)胞那樣為缺失結(jié)構(gòu)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒提供結(jié)構(gòu)蛋白,因而在宿主細(xì)胞內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生新的毒顆粒,保證了該載體在生物制品領(lǐng)域的生物安全性問(wèn)題。
蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定服務(wù)
蛋白質(zhì)(protein)是有機(jī)大分子,是構(gòu)成細(xì)胞的基本有機(jī)物和生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者。蛋白質(zhì)在催化生命體內(nèi)各種反應(yīng)進(jìn)行、新陳代謝、抵御外來(lái)物質(zhì)入l侵及控制遺傳信息等方面都起著重要的作用。蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是氨基酸序列,通過(guò)鑒定氨基酸序列來(lái)匹配它的蛋白質(zhì),這是定性研究,是蛋白質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ),也是蛋白質(zhì)組學(xué)的重要技術(shù)之一。
質(zhì)譜一般由離子源、質(zhì)量分析器(Mass analyzer)和離子檢測(cè)器(Detector)三部分組成。傳統(tǒng)的質(zhì)譜僅用于小分子揮發(fā)物質(zhì)的分析,但隨著新的離子化技術(shù)的出現(xiàn),如基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)和電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)等,質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)為蛋白質(zhì)分析提供了一種新的途徑。現(xiàn)在蛋白質(zhì)組學(xué)基本研究手段是:以生物質(zhì)譜技術(shù)為核心,對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模、高通量分離、鑒定和分析。
蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定的基本原理是用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成肽段混合物,經(jīng)MAILDI或ESI等軟電離手段將其離子化,然后通過(guò)質(zhì)量分析器將具有特定質(zhì)核比的肽段離子分離開(kāi)來(lái)。通過(guò)實(shí)際譜圖和理論上蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)蛋白酶消化后產(chǎn)生的一級(jí)質(zhì)譜峰圖和二級(jí)質(zhì)譜峰圖進(jìn)行的比對(duì),進(jìn)行蛋白鑒定。