血管生成技術(shù)

一、服務(wù)介紹

zhong瘤血管生成是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，一般包括包括血管內(nèi)皮基質(zhì)降解、內(nèi)皮細(xì)胞移行、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、內(nèi)皮細(xì)胞管道化分支形成血管環(huán)和形成新的基底膜等步驟。(3)PBS緩沖液充分漂洗軟gu小塊3次，然后用小剪刀將軟gu塊切碎至約Imm3大小。由于zhong瘤組織這種新生血管結(jié)構(gòu)及功能異常，且血管基質(zhì)不完善，這種微血管容易發(fā)生滲漏，因此腫liu細(xì)胞不需經(jīng)過復(fù)雜的侵襲過程而直接穿透到血管內(nèi)進(jìn)入血流并在遠(yuǎn)隔部位形成轉(zhuǎn)移。

血管生成（Angiogenesis）是指源于已存在的mao細(xì)血管和毛xi血管后微靜脈新的mao細(xì)血管性血管的生長。(6)用含15%胎牛xue清及青鏈mei素的DMEM/F12以106/mL的細(xì)胞濃度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置37°C、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。無論原發(fā)性zhong瘤還是繼發(fā)性zhong瘤，一旦生長直徑超過1~2 mm，都會(huì)有血管生成。這是由于zhongt瘤細(xì)胞自身可分泌多種生長因子，誘導(dǎo)血管生成。

三、自噬過程進(jìn)行觀察和檢測

1、觀察自噬體的形成

由于自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。計(jì)算出應(yīng)稀釋的倍數(shù)，按MTT試劑盒要求在96孔板內(nèi)接種相應(yīng)濃度的細(xì)胞懸液。Phagophore的特征為:新月狀或杯狀，雙層或多層膜,有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體(AV1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。自噬溶酶體(AV2 )的特征為:單層膜，胞漿成分己降解。( autophagic vacuolo AV )

2、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋 白來示蹤自噬形成由于電鏡耗時(shí)長，不利于監(jiān)測(Monitoring) 自噬形成，人們利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了此技術(shù)。(autophagicvacuoloAV)2、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來示蹤自噬形成由于電鏡耗時(shí)長，不利于監(jiān)測(Monitoring)自噬形成，人們利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了此技術(shù)。無自噬時(shí)，GFP-LC3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時(shí)，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn) 位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體，可以通過計(jì)數(shù)來評(píng)價(jià)自噬活性的高低。

3、利用Western Blot檢測LC3-II/比值的變化以評(píng)價(jià)自噬形成自噬形成時(shí)，胞漿型LC3 (即 LC3-I)會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即LC3-ID，因此，LC3-II/比值 的大小可估計(jì)自噬水平的高低。常用的染色法包括臺(tái)盼藍(lán)、橙/化乙啶（AO/EB）、Giemsa和HE法等。(注意: LC3對(duì)LC3-II有更高的親和力，會(huì)造成假陽性。方法2和3需結(jié)合使用，同時(shí)需考慮溶酶體活性的影響。)

4、MDC (Monodansylcadaverine ，單丹磺酰尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的。

5、CellTrackerTM Green染色:主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的。

選擇實(shí)驗(yàn)外包公司需要注意哪些事項(xiàng)？

報(bào)價(jià)

報(bào)價(jià)單一定要有明細(xì)。規(guī)范的外包公司會(huì)根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案里的各項(xiàng)內(nèi)容進(jìn)行核算報(bào)價(jià)，材料是多少、人工檢測是多少，可以看到每一筆錢花在哪里，避免籠統(tǒng)的報(bào)價(jià)。另外注意不要一味地追求低價(jià)，做過實(shí)驗(yàn)的都知道實(shí)驗(yàn)成本，外包還需要考慮人工成本。如果價(jià)格過低，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)就難以保證可靠和來源了。7%兩個(gè)濃度的低溶點(diǎn)瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40日中不會(huì)凝固。當(dāng)然報(bào)價(jià)也不能虛高，做好是能在有限的經(jīng)費(fèi)中盡量保證課題完整性。可以要求公司根據(jù)預(yù)算來調(diào)整優(yōu)化方案，盡可能節(jié)約成本。