低溫生物菌種——菌種分離方法

組織分離法

先將所需的藥用真菌采集回來，選取新鮮、個體大、壯實(shí)、中齡及無病蟲害的子實(shí)體（或菌核、菌索），作為分離用的材料。若為子實(shí)體，取其菌蓋或菌柄組織；若為菌核，取其全部或部分（如茯苓）菌核；若為菌索，取其部分根狀菌索（如蜜環(huán)菌）。再用75 %酒精進(jìn)行表面消毒2 分鐘，用無菌水（或冷開水）沖洗數(shù)次，洗凈殘留的藥液后切成小塊。，然后，放入PDA 培養(yǎng)基的試管或培養(yǎng)皿上，置24 ～26℃溫度下，培養(yǎng)5 ～ 7 天。在分離的真菌組織周圍見長有白色菌絲時(shí)，應(yīng)及時(shí)將菌絲移至斜面試管培養(yǎng)基上，再置溫度24 ～26 ℃下培養(yǎng)7～10 天，即得純菌種。所得的純菌種還可繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)或保藏。

微生物菌種的作用

刺激作物生

有些微生物肥料中的微生物還可分泌植物類物質(zhì)、維生素等，刺激和調(diào)節(jié)作物生長發(fā)育。例如，固氮菌等能夠產(chǎn)生多種活性物質(zhì)(生長素、環(huán)己六醇、泛酸、吡哆醇、硫胺素等)，固氮菌培養(yǎng)物中可檢測到3-乙酸；熒光假單孢菌的所有菌株均能產(chǎn)生赤素和類赤素物質(zhì)，部分菌株還能產(chǎn)生乙酸，少數(shù)菌株能合成生物素和泛酸；叢枝菌根真菌能誘導(dǎo)牧草植株產(chǎn)生細(xì)胞分裂素(CTK)，改變脫落酸(ABA)與赤素的比例。

低溫生物菌種——常用菌種介紹

側(cè)孢芽孢菌

在延遲期， 短芽孢菌為革蘭氏染色陰性，菌體呈細(xì)長的桿狀；在對數(shù)生長期，為革蘭氏染色陽性，菌體成短而粗的桿狀；在靜止期，革蘭氏染色又轉(zhuǎn)為陰性，菌體成細(xì)長的桿狀，偶爾也能觀察到橢圓形的芽孢。圖1是50號菌用1%H2SO4(pH6.8)負(fù)染后的電鏡照片：菌體桿狀、周生鞭毛、大小約0.88μm×2.2μm。

作為非脊椎動物的病原菌，有關(guān)研究人員曾報(bào)道了這種細(xì)菌的殺線蟲能力，由于所報(bào)道的這些側(cè)孢短芽孢菌菌株都不產(chǎn)生伴孢晶體，所以這些菌株的殺線蟲毒力因子并非來自于具有特征性的伴孢晶體。然而，Smirnova TA，et al.分離到了2株能形成大的伴孢晶體的側(cè)孢短芽孢菌菌株，這兩株菌顯示出很強(qiáng)的殺昆蟲能力，研究證實(shí)，這種能力與菌體在形成芽孢過程中的伴孢晶體相關(guān)。有趣的是，Singer的實(shí)驗(yàn)表明，一株側(cè)孢短芽孢菌的殺線活性源于一個熱穩(wěn)定蛋白的毒性。所有這些研究表明，不同側(cè)孢短芽孢菌菌株擁有不同的線蟲致病因子。牛秋紅研究小組分離到的側(cè)孢短芽孢菌G4菌株具有顯著的殺線蟲功能，但其并不產(chǎn)生伴孢晶體。從該菌株的發(fā)酵液里提取的粗蛋白酶液在12h內(nèi)能殺掉所有測試線蟲并在24h內(nèi)完全降解。從側(cè)孢短芽孢菌G4菌株中純化出的絲氨酸胞外蛋白酶可水解多種底物，包括膠原和線蟲體壁，具有很強(qiáng)的殺線蟲能力，組織病理電鏡實(shí)驗(yàn)證實(shí)這種蛋白酶嚴(yán)重破壞了線蟲體壁。而且，蛋白酶將線蟲體壁分解成為一些氨基酸或小肽，這些營養(yǎng)物使病原細(xì)菌更好的生長繁殖。該蛋白酶基因異源表達(dá)的菌株表現(xiàn)出了明顯的殺線蟲活性，重組蛋白酶在體外對線蟲體壁降解，而蛋白酶缺失菌株喪失了大部分的殺線活性，死的線蟲在生測中保持了完整的體壁，表明蛋白酶在線蟲侵染中起主要作用。