小鼠精原gan細(xì)胞分離富集和培養(yǎng)

成年小鼠gao丸中約有108個(gè)細(xì)胞,其中約有 2×104個(gè)是精原gan細(xì)胞,僅占gao丸生精上皮細(xì)胞總數(shù)的 0.02～0.03%,精原gan細(xì)胞數(shù)量太少不利于體外培養(yǎng).分離和富集精原gan細(xì)胞成為精原gan細(xì)胞體外培養(yǎng)能否成功的前提條件.尋找分離和富集小鼠精原gan細(xì)胞有效方法. 方法:出生6-8天小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,先用0.25%胰酶1mM EDTA消化gao丸10min,用胎牛xue清終止消化,用一次40-um孔徑的濾器過(guò)慮制成單 細(xì)胞懸液,30%percoll不連續(xù)密度梯度法離心富集精原gan細(xì)胞,再根椐未分化精原gan細(xì)胞表面thy1.2(CD90.2)陽(yáng)性CD117(c- kit)陰性特點(diǎn)用流式細(xì)胞儀將精原gan細(xì)胞分選出來(lái),并在體外進(jìn)行培養(yǎng)嘗試. 結(jié)果:30%percoll密度梯度離心前CD117(c-kit)陽(yáng)性細(xì)胞占13.80±3.34%,CD90.2陽(yáng)性細(xì)胞占28.98±4.51%, 二者都陽(yáng)性細(xì)胞占8.98±2.98%,CD117陰性CD90.2陽(yáng)性細(xì)胞占18.36±2.67%;離心后 CD117(c-kit)陽(yáng)性細(xì)胞占12.37±3.34%,CD90.2陽(yáng)性細(xì)胞占56.98±4.51%,二者都陽(yáng)性細(xì)胞占 8.20±3.98%,CD117陰性CD90.2陽(yáng)性細(xì)胞占32.36±3.67%;CD117(c-kit)陽(yáng)性細(xì)胞和二者都陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比前后 比較差異無(wú)顯著性(P>0.1),CD90.2陽(yáng)性細(xì)胞和CD117陰性和CD90.2陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比前后比較差異有顯著性 (P<0.05);采用CD117和CD90.2作為標(biāo)志分子,percoll離心后細(xì)胞懸液經(jīng)FACS分選后獲得細(xì)胞純度

自噬流檢測(cè)

自噬是調(diào)節(jié)真核細(xì)鵬生長(zhǎng)、和能量代謝的重要生物學(xué)機(jī)制。細(xì)胞自噬行使其生物學(xué)功能的前提是自噬流的話化。大量證據(jù)表明自噬流受損與多種慢性炎性疾病，特別是、神經(jīng)退行性疾病及組織纖維化的發(fā)病密切相關(guān)，目前對(duì)于自噬液的檢別是自噬與其相關(guān)疾病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。由于自噬流是一個(gè)曲多個(gè)步驟組成的動(dòng)態(tài)過(guò)程。5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃過(guò)夜，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min。因此往需要精細(xì)的突驗(yàn)才能準(zhǔn)確判斷自啦流狀態(tài)。

小鼠成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立

細(xì)胞之間的相互調(diào)控作用奠定基礎(chǔ).方法利用24 h內(nèi)新生小鼠顱骨和4~8周齡成年小鼠四肢長(zhǎng)分別分離、培養(yǎng)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，采用間接接觸的培養(yǎng)模式將接種了骨sui單核細(xì)胞的玻片或骨片置入提前24 h接種了成骨細(xì)胞的培養(yǎng)皿中進(jìn)行共培養(yǎng).共培養(yǎng)-定時(shí)間后進(jìn)行破 骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP染色鑒定和骨吸收功能檢測(cè)，并進(jìn)一 步采用RT- PCR對(duì)破骨細(xì)胞標(biāo)志酶基因基質(zhì)金屬蛋白酶.9(MMP-9)、TRAP 和組織蛋白酶K (Cathepsin K )的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果共培養(yǎng)5天后可觀TRAP( )多核細(xì)胞形成13天TRAP( )多核細(xì)胞數(shù)目達(dá)到高峰;骨吸收陷窩在共培養(yǎng)7天后開(kāi)始出現(xiàn),隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),陷窩面積呈增加趨勢(shì);破骨細(xì)胞標(biāo)志基因TRAP在共培養(yǎng)3天時(shí)開(kāi)始表達(dá)，而MMP-9和Cathepsin K則在共培養(yǎng)5天后表達(dá)結(jié)論共培養(yǎng)體系中成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞調(diào)控作用顯著誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞具有噬骨能力，該共培養(yǎng)模型可用于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的相互調(diào)控作用研究.