二、大腸菌群檢驗(yàn)方法:

由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，即:需氧及兼性厭氧、在37°C能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無(wú)芽胞。因此大腸菌群的檢測(cè)一般都是按照它的定義進(jìn)行。平臺(tái)成熟可靠：采用Agilent原位噴墨合成技術(shù)，了高檢測(cè)靈敏度和特異性。 目前國(guó)內(nèi)采用的進(jìn)出口食品大腸菌群檢測(cè)方法主要有和原國(guó)家商檢局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法在檢測(cè)程序上略有不同。

(一):采用三步法，即:乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、分離培養(yǎng)和證實(shí)試驗(yàn)。乳糖發(fā)酵試驗(yàn):樣品稀釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。36士1C培養(yǎng)48土2h，觀(guān)察是否產(chǎn)氣。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細(xì)胞裂解緩沖液勻漿至不見(jiàn)組織塊，轉(zhuǎn)入1。分離培養(yǎng):將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，36士1°C培養(yǎng)18-24h，觀(guān)察菌落形態(tài)。證實(shí)試驗(yàn):挑取平板上的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色觀(guān)察。同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管36士1°C培養(yǎng)24土2h,觀(guān)察產(chǎn)氣情況。

報(bào)告:

根據(jù)證實(shí)為大腸陽(yáng)性的管數(shù)，查MPN表，報(bào)告每100ml ( g)大腸菌群的MPN值。具體操作參見(jiàn)GB4789. 3-94 《中華人民共和國(guó)食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群測(cè)定》

(二)原國(guó)家商檢局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，等效采用美國(guó)FDA的標(biāo)準(zhǔn)方法，用于對(duì)出口食品中的大腸進(jìn)行檢測(cè)。本方法采用兩步法：推測(cè)試驗(yàn):樣品稀釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯。36士1C培養(yǎng)48士2h，觀(guān)察是否產(chǎn)氣。其基礎(chǔ)是在強(qiáng)電場(chǎng)下不同分子的由于其所帶電荷，大小，結(jié)構(gòu)以及疏水性等不同而相互分開(kāi)。證實(shí)試驗(yàn):將產(chǎn)氣管培養(yǎng)物接種煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯管中，36士1°C培養(yǎng)48士2h，觀(guān)察是否產(chǎn)氣。以BGLB產(chǎn)氣為陽(yáng)性。查MPN表，報(bào)告每ml(g)樣品中大腸菌群的MPN值。具體操作參見(jiàn)SN0169-92《中華人民共和國(guó)進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸檢驗(yàn)方法》

染色質(zhì)免l疫共沉淀技術(shù)(ChIP)

基于體內(nèi)分析而發(fā)展的染色質(zhì)免l疫沉淀分析Chr omat in immunoprecipitat ionassay kit, ChIP)技術(shù)可以真實(shí)、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的調(diào)控蛋白。由于ChIP采用甲醛固定活l細(xì)胞或者組織的方法，因此能比較真實(shí)的反映細(xì)胞內(nèi)TF與Promoter的結(jié)合情況，還可以用來(lái)研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系?；瘜W(xué)鍵合固定相，根據(jù)鍵合的基團(tuán)不同可用于反相或正相色譜，其中常用的是十八烷基硅l烷(又稱(chēng)ODS)鍵合硅膠，可用于反相色譜或離子對(duì)色譜離子交換填料，用于離子交換色譜，是有一定孔徑的大孔填料，用于排阻色譜。近年來(lái),這種技術(shù)得到不斷的發(fā)展和完善。采用結(jié)合微陣列技術(shù)在染色體基因表達(dá)調(diào)控區(qū)域檢查染色體活性,是深入分析癌l癥、心血l管病以及中央神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等疾病主要通路的一-種非常有效的工具。

染色質(zhì)免l疫沉淀分析(ChIP) 的基本原理是在活l細(xì)胞狀態(tài)下，當(dāng)用甲醛處理時(shí)，相互靠近的蛋白與蛋白、蛋白與核酸(DNA或RNA)之間會(huì)產(chǎn)生共價(jià)鍵。細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)F與Promoter相互結(jié)合時(shí)，它們必然靠的比較近或者契合在一起，這個(gè)時(shí)候用甲醛處理，能使它們之間產(chǎn)生共價(jià)鍵。此外，Illumina還捕獲了未翻譯的區(qū)域，這是NimbleGen和安捷倫平臺(tái)無(wú)法靶定的。固定的蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物通過(guò)超聲或酶處理將其隨機(jī)切斷為-定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段然后通過(guò)抗原抗l體的特異性識(shí)別反應(yīng)沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNAl片段，通過(guò)對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。通過(guò)qPCR或二代測(cè)序，篩選與目的蛋白互作的未知DNA信息。

25.PCR擴(kuò)增不出就引物有問(wèn)題嗎？

答：基本不是。當(dāng)今發(fā)展出各色各樣的PCR擴(kuò)增技術(shù)，各色各樣的高溫聚合酶，就是來(lái)解決PCR擴(kuò)增中遇到的擴(kuò)不出、擴(kuò)增效率低的問(wèn)題。如巢式PCR就是擴(kuò)增那些拷貝數(shù)很低的基因片段。 有些重復(fù)片段的擴(kuò)增, GC含量高的片段，非要采用特殊擴(kuò)增手段才能擴(kuò)增出了。分離培養(yǎng):將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，36士1°C培養(yǎng)18-24h，觀(guān)察菌落形態(tài)。

引物擴(kuò)增不出，主要是下列兩種情況比較常見(jiàn)：

（1） RT-PCR。請(qǐng)注意，很多基因通過(guò)常規(guī)RT -PCR方法是很難擴(kuò)增出來(lái)的。 RT- PCR成功的關(guān)鍵在于RT的反應(yīng)的RNA質(zhì)量和目標(biāo)基因在特定組織和細(xì)胞中含量。

（2）從基因組中擴(kuò)增。一般情況下，基因在基因組中都是單拷貝，基因組作為模板需要嚴(yán)格控制用量?；蚪MDNA過(guò)高，會(huì)影響反應(yīng)體系中的Mg和pH