新技術(shù)提升蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率

超構(gòu)材料21世紀(jì)初被提出，截至目前它仍然是非?；钴S的前沿領(lǐng)域。其中的微結(jié)構(gòu)，大小尺度與它作用的蛋白質(zhì)尺寸相當(dāng)，因此得以對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)晶過(guò)程施加干預(yù)，對(duì)蛋白質(zhì)的聚集態(tài)形成起到促進(jìn)作用，從而降低了兩步成核中的步能壘。其次，通過(guò)材料本體結(jié)構(gòu)的晶格對(duì)聚集態(tài)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行引導(dǎo)排列，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子的有序排列和晶核形成，從而降低了兩步成核中的第二步能壘。

盡管通過(guò)實(shí)驗(yàn)和理論證明了超構(gòu)材料在蛋白質(zhì)結(jié)晶方面的巨大潛力，但要充分發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)則必須兼容當(dāng)前蛋白質(zhì)結(jié)晶通過(guò)的高通量篩選系統(tǒng)。目前國(guó)際上普遍采用液體處理機(jī)器人來(lái)進(jìn)行高通量結(jié)晶篩選，篩選一個(gè)結(jié)晶條件的蛋白樣品消耗體積為納升級(jí)別。因此，如何快速，穩(wěn)定地將成核劑添加到高通量系統(tǒng)的同時(shí)，又不對(duì)結(jié)晶系統(tǒng)造成大的影響成為急需解決的問(wèn)題。

隨后通過(guò)優(yōu)化生產(chǎn)和制備工藝，考察了各生產(chǎn)因素對(duì)成核劑尺寸和穩(wěn)定性的影響，確定了適合高通量蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選的成核劑混懸劑的制備工藝流程。這是一種含有具有表面超結(jié)構(gòu)的有機(jī)無(wú)機(jī)復(fù)合材料，其尺寸分布在幾百納米到幾微米之間。該產(chǎn)品的組成為材料顆粒與水溶液的混懸液。在蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選實(shí)驗(yàn)中，使用該產(chǎn)品有助于提高蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選的成功率，包括改善晶體的分辨率和篩選新的結(jié)晶條件，使不結(jié)晶或難結(jié)晶的蛋白質(zhì)成功結(jié)晶，展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力，使用該成核劑已經(jīng)成功結(jié)晶和解析十多個(gè)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)。

此外，針對(duì)能夠結(jié)晶的蛋白質(zhì)分子，成核劑混懸液在篩選新的結(jié)晶條件，提升結(jié)晶的分辨率方面同樣有效。目前，先進(jìn)院已經(jīng)與國(guó)內(nèi)超過(guò)18個(gè)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了合作，助力我國(guó)的生命科學(xué)和生物研究。

蛋白質(zhì)結(jié)晶涉及四個(gè)重要步驟

1. 蛋白質(zhì)純度的確定。如果不夠非常純，必須要進(jìn)一步純化。

2. 蛋白質(zhì)溶解于合適的溶劑中，從中它能通過(guò)一種鹽或有機(jī)化合物而析出。溶劑通常是水-緩沖劑溶液，有時(shí)加，如2--2，4-（MPD）。正常情況下，沉淀劑也被加入，但是濃度不高于使沉淀產(chǎn)生。對(duì)于不溶于水-緩沖劑或水-的膜蛋白，還需要加入去污劑。

3. 使溶液過(guò)飽和。在這一步中，小聚集體形成，它是晶體生長(zhǎng)所需的核。對(duì)小分子的結(jié)晶來(lái)說(shuō)，相比于蛋白質(zhì)更為人熟知，晶核的自發(fā)形成需要提供表面張力能。一旦這個(gè)能障被突破了，晶體開(kāi)始生長(zhǎng)。能障在高水平的過(guò)飽和度時(shí)很容易克服。因此，在高過(guò)飽和度時(shí)，晶核更易自發(fā)形成。晶核的形成可作為一個(gè)過(guò)飽和度和其他參數(shù)的函數(shù)通過(guò)多種方法來(lái)研究，包括光散射、熒光去極化及電子顯微鏡。

4. 一旦晶核形成，晶體生長(zhǎng)正式開(kāi)始。對(duì)低分子量的化合物而言，新分子會(huì)逐步結(jié)合到正在生長(zhǎng)的晶體表面。這是由于這些位置的結(jié)合能比較大，相對(duì)于分子結(jié)合到平滑的表面。這些步驟要么由晶系缺陷造成，要么發(fā)生在表面隨機(jī)形成的晶核。

傳統(tǒng)結(jié)晶板蛋白質(zhì)晶體板比較

在20℃時(shí)雖然微流控芯片上的結(jié)晶條件數(shù)少于24孔結(jié)晶板(67 vs 94),但主要是嗜熱菌蛋白酶的結(jié)晶條件數(shù)顯著減少,其他4種蛋白在兩種方法上均有相近的結(jié)晶條件數(shù),表明微流控芯片能以接近24孔結(jié)晶板的效率進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選.但是,在4℃時(shí)微流控芯片與24孔結(jié)晶板有60%的結(jié)晶條件不同,20℃時(shí)有90%的結(jié)晶條件不同,這表明目前的這種微流控芯片還不能直接代替?zhèn)鹘y(tǒng)的24孔結(jié)晶板,它可以作為蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選時(shí)的一種補(bǔ)充方式。

蛋白結(jié)晶板作用

蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的載體,研究其分子結(jié)構(gòu)及發(fā)揮生物活性的機(jī)制具有重要意義.結(jié)晶作為研究生物大分子結(jié)構(gòu)及功能的重要手段,近年來(lái)發(fā)展迅速.介紹影響蛋白質(zhì)結(jié)晶的因素、目前常用的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法以及提高蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選率和衍射質(zhì)量的新技術(shù)和新策略,這對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)晶的研究有一定的推動(dòng)作用。

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