自噬流檢測(cè)

自噬是調(diào)節(jié)真核細(xì)鵬生長(zhǎng)、和能量代謝的重要生物學(xué)機(jī)制。細(xì)胞自噬行使其生物學(xué)功能的前提是自噬流的話化。大量證據(jù)表明自噬流受損與多種慢性炎性疾病，特別是、神經(jīng)退行性疾病及組織纖維化的發(fā)病密切相關(guān)，目前對(duì)于自噬液的檢別是自噬與其相關(guān)疾病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。由于自噬流是一個(gè)曲多個(gè)步驟組成的動(dòng)態(tài)過(guò)程。然后去固定液，加適量GIMSA應(yīng)用染色液染10~30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。因此往需要精細(xì)的突驗(yàn)才能準(zhǔn)確判斷自啦流狀態(tài)。

細(xì)胞分化

細(xì)胞分化是指同一來(lái)源的細(xì)胞逐漸產(chǎn)生出形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能特征各不相同的細(xì)胞類群的過(guò)程，其結(jié)果是在空間上細(xì)胞產(chǎn)生差異，在時(shí)間上同一細(xì)胞與其從前的狀態(tài)有所不同。細(xì)胞分化的本質(zhì)是基因組在時(shí)間和空間上的選擇性表達(dá)，通過(guò)不同基因表達(dá)的開啟或關(guān)閉，終產(chǎn)生標(biāo)志性蛋白質(zhì)。常用的解鏈方法為鹽酸加熱、蛋白酶處理等，使DNA雙鏈部分單鏈化，抗Brdu小鼠單與增殖細(xì)胞核內(nèi)的Brdu結(jié)合，再經(jīng)酶標(biāo)抗小鼠IgG孵育、呈色，顯示進(jìn)入S期細(xì)胞的情況。細(xì)胞誘導(dǎo)是指將一群不同類型或者形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能特征存在差異的細(xì)胞通過(guò)生物學(xué)、物理學(xué)等手段，將之轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂邢嗨?相同形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能特征的細(xì)胞群體的過(guò)程。

目的

學(xué)習(xí)和掌握外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的主要方法——脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。了解外源基因進(jìn)入的一般性方法，觀測(cè)外源蛋白的表達(dá)（綠色熒光蛋白），為染色準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料。

實(shí)驗(yàn)原理

上圖所示是脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的示意圖，它顯示了外源質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞的一般過(guò)程。

外源基因進(jìn)入細(xì)胞主要有四種方法：法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。法是在細(xì)胞上短時(shí)間暫時(shí)性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入；磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過(guò)直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞；3、將質(zhì)粒DNA(約2-4ul)2ul加入dorf管中 DMEM至50u1。病毒法是利用包裝了外源基因的病毒細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞。但是由于法和磷酸鈣法的實(shí)驗(yàn)條件控制較嚴(yán)、難度較大；病毒法的前期準(zhǔn)備較復(fù)雜、而且可能對(duì)于細(xì)胞有較大影響；所以現(xiàn)在對(duì)于很多普通細(xì)胞系，一般的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法。

利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問(wèn)題，通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對(duì)于效率的提高有巨大的作用。