小鼠精原gan細胞分離富集和培養(yǎng)

成年小鼠gao丸中約有108個細胞,其中約有 2×104個是精原gan細胞,僅占gao丸生精上皮細胞總數(shù)的 0.02～0.03%,精原gan細胞數(shù)量太少不利于體外培養(yǎng).分離和富集精原gan細胞成為精原gan細胞體外培養(yǎng)能否成功的前提條件.尋找分離和富集小鼠精原gan細胞有效方法. 方法:出生6-8天小鼠為實驗對象,先用0.25%胰酶1mM EDTA消化gao丸10min,用胎牛xue清終止消化,用一次40-um孔徑的濾器過慮制成單 細胞懸液,30%percoll不連續(xù)密度梯度法離心富集精原gan細胞,再根椐未分化精原gan細胞表面thy1.2(CD90.2)陽性CD117(c- kit)陰性特點用流式細胞儀將精原gan細胞分選出來,并在體外進行培養(yǎng)嘗試. 結(jié)果:30%percoll密度梯度離心前CD117(c-kit)陽性細胞占13.80±3.34%,CD90.2陽性細胞占28.98±4.51%, 二者都陽性細胞占8.98±2.98%,CD117陰性CD90.2陽性細胞占18.36±2.67%;離心后 CD117(c-kit)陽性細胞占12.37±3.34%,CD90.2陽性細胞占56.98±4.51%,二者都陽性細胞占 8.20±3.98%,CD117陰性CD90.2陽性細胞占32.36±3.67%;CD117(c-kit)陽性細胞和二者都陽性細胞所占百分比前后 比較差異無顯著性(P>0.1),CD90.2陽性細胞和CD117陰性和CD90.2陽性細胞所占百分比前后比較差異有顯著性 (P<0.05);采用CD117和CD90.2作為標志分子,percoll離心后細胞懸液經(jīng)FACS分選后獲得細胞純度

自噬流檢測

自噬是調(diào)節(jié)真核細鵬生長、和能量代謝的重要生物學機制。細胞自噬行使其生物學功能的前提是自噬流的話化。大量證據(jù)表明自噬流受損與多種慢性炎性疾病，特別是、神經(jīng)退行性疾病及組織纖維化的發(fā)病密切相關，目前對于自噬液的檢別是自噬與其相關疾病研究領域的熱點。由于自噬流是一個曲多個步驟組成的動態(tài)過程。5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃過夜，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min。因此往需要精細的突驗才能準確判斷自啦流狀態(tài)。

小鼠成骨細胞和破骨細胞共培養(yǎng)模型的建立

細胞之間的相互調(diào)控作用奠定基礎.方法利用24 h內(nèi)新生小鼠顱骨和4~8周齡成年小鼠四肢長分別分離、培養(yǎng)成骨細胞和破骨細胞，采用間接接觸的培養(yǎng)模式將接種了骨sui單核細胞的玻片或骨片置入提前24 h接種了成骨細胞的培養(yǎng)皿中進行共培養(yǎng).共培養(yǎng)-定時間后進行破 骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP染色鑒定和骨吸收功能檢測，并進一 步采用RT- PCR對破骨細胞標志酶基因基質(zhì)金屬蛋白酶.9(MMP-9)、TRAP 和組織蛋白酶K (Cathepsin K )的表達進行檢測結(jié)果共培養(yǎng)5天后可觀TRAP( )多核細胞形成13天TRAP( )多核細胞數(shù)目達到高峰;骨吸收陷窩在共培養(yǎng)7天后開始出現(xiàn),隨著培養(yǎng)時間的延長,陷窩面積呈增加趨勢;破骨細胞標志基因TRAP在共培養(yǎng)3天時開始表達，而MMP-9和Cathepsin K則在共培養(yǎng)5天后表達結(jié)論共培養(yǎng)體系中成骨細胞對破骨細胞調(diào)控作用顯著誘導的破骨細胞具有噬骨能力，該共培養(yǎng)模型可用于成骨細胞和破骨細胞之間的相互調(diào)控作用研究.