慢病毒包裝

1、細(xì)胞準(zhǔn)備：細(xì)胞傳到后，密度達(dá)到70％左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；

2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染:取兩個(gè)EP管，一個(gè)加入Opti-MEM、核心質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒；另一個(gè)加入Opti-MEM、lipo2000，然后將兩管混勻；

3、細(xì)胞孵育：將混合液逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，混勻后孵育；

4、收集病毒：轉(zhuǎn)染后48h、72h收集含慢病毒的上清；

5、滴度檢測:細(xì)胞為30%－50％時(shí)加入病毒上清液，檢測陽性細(xì)胞比例。

甲l基化特異性的PCR

Herman 等（ 1996 ）在使用重亞硫酸鹽處理的基礎(chǔ)上新建的一種方法。該方法敏感性高，主要用于作定性研究。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生jia基化的胞嘧定被轉(zhuǎn)化為尿嘧ding，而jia基化的胞嘧定不變；隨后設(shè)計(jì)針對(duì)jia基化和非jia基化序列的引物進(jìn)行PCR。通過電泳檢測MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對(duì)處理后jia基化DNA鏈的引物能得到擴(kuò)增片段，則說明該位點(diǎn)存在jia基化；反之，說明被檢測的位點(diǎn)不存在jia基化。

特點(diǎn)：適用范圍廣，能夠檢測特異位點(diǎn)是否發(fā)生jia基化。

亞硫酸氫鹽測序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

亞硫酸氫鹽修飾后測序法（ BSP ） Frommer 等（ 1992 ）提出的研究 DNA jia基化方法，此方法可靠性及jing確度高，能明確目的片段中每一個(gè) CpG 位點(diǎn)的jia基化狀態(tài)。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生jia基化的胞嘧ding被轉(zhuǎn)化為尿嘧ding，而jia基化的胞嘧ding不變。隨后設(shè)計(jì)BSP引物進(jìn)行PCR，在擴(kuò)增過程中尿嘧定全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧定，zui后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序就可以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生jia基化，稱為BSP-直接測序法。將PCR產(chǎn)物克long至載體后進(jìn)行測序，可以提高測序成功率，這種方法稱為BSP-ke隆測序法。

特點(diǎn)：jing確度高，能夠準(zhǔn)確檢測出jia基化的程度百分比。

STR檢測

短串聯(lián)重復(fù)(Short tandem repeats, STR)，又稱微wei星DNA(Microsatellite DNA)或簡單重復(fù)序列(Simple repeat sequence, SRS或SSR)，是廣泛存在于原核生物和真核生物基因組中的核苷酸重復(fù)序列。有絲分裂過程中DNA鏈之間的錯(cuò)配引起的fu制滑動(dòng)被認(rèn)為是導(dǎo)致STR產(chǎn)生的較為常見原因，并且依據(jù)不同fu制單元大小的不同以及不同物種之間，fu制滑動(dòng)發(fā)生的概率也不相同。

STR是以核心序列 (core repeat units) 首尾相連多次重復(fù)形成。每個(gè)STR的核心序列結(jié)構(gòu)相同，長度為2-6bp，但其重復(fù)單位數(shù)目和重復(fù)區(qū)域的長度不同，因此STR在不同種族、不同人群之間的分布具有差異性，構(gòu)成了STR遺傳多態(tài)性。不同個(gè)體之間在一個(gè)同源STR位點(diǎn)的重復(fù)次數(shù)也不同，因而同指紋識(shí)別一樣，STR位點(diǎn)分析也可對(duì)個(gè)體進(jìn)行身份識(shí)別。通過識(shí)別個(gè)體基因組在特定位點(diǎn)的特定序列重復(fù)，即可創(chuàng)建其基因檔案?；诖?，STR分析法已經(jīng)成為一種重要的鑒定分析方法，應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)、qin子鑒定及細(xì)胞鑒定等領(lǐng)域。