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發(fā)布時(shí)間:2021-08-30 01:33  
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典型的腺病毒載體系統(tǒng)如:穿梭質(zhì)粒pCA13/腺病毒基因組質(zhì)粒pBHG11/包裝細(xì)胞293細(xì)胞。pCA13/的HCMV IE啟動(dòng)子-多克1隆位點(diǎn)-SV40 AN(poly A)構(gòu)成外源基因的表達(dá)盒,該表達(dá)盒的插入使腺病毒E1基因缺失,但是保留其兩端側(cè)翼序列(左側(cè)的1~3bp的ITR,右側(cè)從3.5kb到末端的維持病毒裝配和活力必須的蛋白IX的基因),也保留了腺病毒的包裝信號(hào)
φ(194~358bp);pBHG11則保留了腺病毒基因組的絕大部分,但是缺失了包裝信號(hào)φ、0.5~3.7圖距(mu)部分的E1區(qū)、77.5~86.2mu的E3區(qū),293細(xì)胞是整合有Ad5 E1基因的人胚shen細(xì)胞系。pBHG11因?yàn)槿笔Оb信號(hào)及E1區(qū)而不能copy,pCA13帶有包裝信號(hào)及E1的側(cè)翼序列,但是缺失E1區(qū)及腺病毒絕大部分基因組,同樣不能copy。外源目的基因插入pCA13后,與pBHG11共轉(zhuǎn)染,進(jìn)入293細(xì)胞。pCA13與pBHG11在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組,同時(shí),293細(xì)胞提供E1蛋白,從而包裝產(chǎn)生腺病毒顆粒。該病毒的蛋白質(zhì)外殼同野1生型腺病毒相似,具有同樣的感1染力進(jìn)入靶1細(xì)胞的能力,但是基因組DNA的E1區(qū)被外源目的基因取代,即進(jìn)入靶1細(xì)胞后病毒不能copy,但可以表達(dá)目的蛋白。
基因?qū)爰?xì)胞常用方法
不同的載體在不同的宿主細(xì)胞中繁殖,導(dǎo)入細(xì)胞的方法也不相同。
由于外源DNA的進(jìn)入而使細(xì)胞遺傳性改變稱為轉(zhuǎn)化,早在1943年,Avery等就發(fā)現(xiàn)有毒肺1炎雙球菌的DNA與無(wú)毒肺1炎雙球菌共培養(yǎng)后產(chǎn)生有毒性的肺1炎雙球菌后代的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。但DNA進(jìn)入細(xì)胞的效率很低,在分子生物學(xué)和基因工程工作中可采取一些方法處理細(xì)胞,經(jīng)處理后的細(xì)胞就容易接受外界DNA,稱為感受態(tài)細(xì)胞,再與外源DNA接觸,就能提高轉(zhuǎn)化效率。例如大腸桿1菌經(jīng)冰冷CaCl2的處理,就成為感受態(tài)細(xì)菌,當(dāng)加入重組質(zhì)粒并突然由4℃轉(zhuǎn)入42℃作短時(shí)間處理,質(zhì)粒DNA就能進(jìn)入細(xì)菌;用高電壓脈沖短暫作用于細(xì)菌也能顯著提高轉(zhuǎn)化效率,這稱為電穿孔(electroporation)轉(zhuǎn)化法