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發(fā)布時間:2021-06-15 05:01  

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豬流行性腹瀉病毒和非洲病毒都具有在豬源原料中存活的能力;然而,作用機制目前尚不清楚。根據(jù)應(yīng)對流行性腹瀉病毒的經(jīng)驗,在不影響動物性能和飼料成本的情況下,替換原料的可行性使得很多生產(chǎn)者不再使用豬源原料。研究表明熱工過程可以殺滅病毒(如流行性腹瀉病毒),但這只能作為緊急緩解措施,因為這要求產(chǎn)品在干燥和運輸過程中必須不存在交叉污染。而熒光定量PCR可以在反應(yīng)進行過程中進行累積擴增產(chǎn)物的分析和檢測,即“實時”。如果生產(chǎn)者認(rèn)可排除豬源原料是可行的,那么還應(yīng)該考慮到那些間接的豬源原料,像添加劑、基礎(chǔ)混合物和那些可能源于豬源的動物蛋白或脂肪等。

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首先,養(yǎng)豬場(戶)真正了解所使用的飼料原料的供應(yīng)鏈非常重要。包括:從誰那里購買了原料?他們又從哪里買到?在運輸中是否與其他原料混雜或混合?每個中轉(zhuǎn)地點的生物安全政策是什么?這些對于正確評估原料攜帶外來動物疾病的風(fēng)險非常重要。其次,飼料廠要注重生物安全。在不使用時蓋住接收坑,有效地控制害蟲,防止灰塵收集系統(tǒng)中的灰塵再循環(huán)回到飼料中,并管理好整個工廠的人員移動。后,養(yǎng)豬場和飼料廠要考慮監(jiān)測環(huán)境,以實現(xiàn)生物安全合規(guī)性。環(huán)境監(jiān)測在人類食品和寵物食品行業(yè)已經(jīng)成為常規(guī)舉措,可以幫助人們發(fā)現(xiàn)生物安全計劃中的薄弱環(huán)節(jié)。廣州勱博--冷凍食品加工企業(yè)/公司/廠核酸提取純化一般而言,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。


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豬肉制品加工企業(yè)、生豬產(chǎn)品經(jīng)營者采購生豬產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)批批查驗其動物檢疫合格證明、肉品品質(zhì)檢驗合格證明以及非洲病毒檢測結(jié)果(報告),確保購進的生豬產(chǎn)品不帶非洲病毒;采購的進口生豬產(chǎn)品應(yīng)附有合法的入境貨物檢驗檢疫合格證明。不得采購沒有非洲病毒檢測結(jié)果(報告)及未經(jīng)檢疫或者檢疫不合格的生豬產(chǎn)品,確保豬肉制品和經(jīng)營的生豬產(chǎn)品不含非洲病毒。廣州勱博--養(yǎng)殖場PCRPCR檢測同熒光PCR類似,都是使用的引物和探針以VP72編碼區(qū)域作為靶基因設(shè)計,該基因研究清楚,且高度保守,即使在滅活或降解的樣品中也可檢測到已知所有22種p72病毒基因型的多個毒株。

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所謂real-time Q-PCR技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團,利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程,后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。在real-time 技術(shù)的發(fā)展過程中,兩個重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用:(1)在90年代早期,Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn),它能降解特異性熒光記探針,因此使得間接的檢測PCR產(chǎn)物成為可能。(2)此后熒光雙標(biāo)記探針的運用使在一密閉的反應(yīng)管中能實時地監(jiān)測反應(yīng)全過程。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯i仿相,中間層以及無色水相上層。這兩個發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致real-time Q-PCR方法在研究工作中的運用。



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在real-time Q-PCR技術(shù)中,無論是相對定量還是標(biāo)準(zhǔn)曲線定量方法仍存在一些PCR定量方法均有的問題有待解決。在標(biāo)準(zhǔn)曲線定量中,標(biāo)準(zhǔn)品的制備是一個必不可少的過程。目前由于無一統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),各個實驗室所用的生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品各不相同,致使實驗結(jié)果缺乏可比性。實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出,由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。此外,用real-time Q-PCR來研究mRNA時,受到不同RNA樣本存在不同的逆轉(zhuǎn)錄(RT)效率的限制。在相對定量中,其前提是假設(shè)內(nèi)源控制物不受實驗條件的影響的,合理地選擇合適的不受實驗條件影響的內(nèi)源控制物也是實驗結(jié)果可靠與否的關(guān)鍵。

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與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比,Real-time Q-PCR的不足之處是:(1)由于運用了封閉的檢測,減少了擴增后電泳的檢測步驟,因此也就不能監(jiān)測擴增產(chǎn)物的大??;該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。(2)因為熒光素種類以及檢測光源的局限性,從而相對地限制了real-time Q-PCR的復(fù)合式(multiplex)檢測的應(yīng)用能力;(3)目前real-time Q-PCR實驗成本比較高,從而也限制了其廣泛的應(yīng)用。


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傳統(tǒng)的PCR定量是應(yīng)用終點PCR來對樣品中的模板量進行定量,通常用凝膠電泳分離,并用熒光染色來檢測PCR反應(yīng)的終擴增產(chǎn)物。但在PCR反應(yīng)中,由于模板、試劑、焦磷酸鹽分子的聚集等因素影響聚合酶反應(yīng),終導(dǎo)致PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式進行而進入“平臺期”,而且一些反應(yīng)的終產(chǎn)物比另一些要多,因此終點PCR反應(yīng)方法定量并不準(zhǔn)確。研究表明,每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小。此外,終點PCR還容易交叉污染,產(chǎn)生假陽性。

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核酸提取儀原理是,經(jīng)裂解液裂解后,細(xì)胞核中會釋放出核酸分子,會被吸附在磁珠表面,而蛋白質(zhì)等物質(zhì)不會被吸附,結(jié)合了核酸的磁珠被磁性物質(zhì)固定在管壁上轉(zhuǎn)移到洗脫管中,經(jīng)過反復(fù)洗脫,后我們可以得到純凈的DNA。根據(jù)其使用范圍可以分為兩類,一種是大型核酸提取儀,另一種是小型核酸提取儀;主要是利用磁珠純化核酸及蛋白質(zhì)從而達(dá)到提取核酸的目的,在細(xì)胞、動植物組織等研究方面,一個樣品用一個探針,有效防止樣品之間的交叉污染。還有的在入舍消毒池中,只是例行把水和火堿放進去,也不攪拌,火堿靠自身溶解需要較長時間,那剛放好的消毒水的作用就不確實了。