細(xì)胞實驗介紹——流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期：

細(xì)胞周期：指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動過程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期組成。G0/G1期：有絲分裂發(fā)生，細(xì)胞分裂成兩個細(xì)胞，進(jìn)入下一個細(xì)胞周期，或者進(jìn)入靜止期（G0期），而G0期從DNA含量上無法與G1期區(qū)分，細(xì)胞開始RNA和蛋白質(zhì)的合成，但DNA含量仍保持二倍體。S期：DNA開始合成，細(xì)胞核內(nèi)DNA的含量介于G1期和G2期之間。磁性細(xì)胞標(biāo)記方式應(yīng)用MACS技術(shù)進(jìn)行磁性細(xì)胞分選重要的一點(diǎn)是高質(zhì)量的標(biāo)記。G2期和M期：當(dāng)DNA成為4倍體時，細(xì)胞進(jìn)入G2期。G2期細(xì)胞繼續(xù)合成RNA及蛋白質(zhì)，直到進(jìn)入M期。

PI法是經(jīng)典的周期檢測方法。PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結(jié)合，其結(jié)合的量與DNA的含量成正比例關(guān)系，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，就可以得到細(xì)胞周期各個階段的DNA分布狀態(tài)，從而計算出各個期的百分含量。血管生成技術(shù)一、服務(wù)介紹zhong瘤血管生成是一個極其復(fù)雜的過程，一般包括包括血管內(nèi)皮基質(zhì)降解、內(nèi)皮細(xì)胞移行、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、內(nèi)皮細(xì)胞管道化分支形成血管環(huán)和形成新的基底膜等步驟。

一般流程：細(xì)胞收集-70%酒精固定過夜-PI染色-流式細(xì)胞儀檢測。

細(xì)胞凋亡：細(xì)胞凋亡的早期就有細(xì)胞膜表面破損發(fā)生。破損時凋亡細(xì)胞表面的磷脂腺絲氨酸(PS)可以從細(xì)胞內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞的外膜。該過程發(fā)生在之前，檢測PS的表達(dá)，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2 依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對PS有很高的親和性，并且可以與暴露于細(xì)胞外的PS相結(jié)合。(-般而言，陰性分離法的磁珠用量比陽性分離法的大，陽性分離法用行更多。利用這一原理，可以將AnnexinV標(biāo)記熒光來識別早期的細(xì)胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)來區(qū)分凋亡和壞死細(xì)胞。PI的膜通透性很差，因而只能標(biāo)記壞死的細(xì)胞。

一般流程：細(xì)胞收集-PI-AnnexinV標(biāo)記-流式細(xì)胞儀檢測。

結(jié)果示例：

                                   圖 A 細(xì)胞周期檢測圖；B 細(xì)胞凋亡檢測圖

細(xì)胞實驗介紹——細(xì)胞運(yùn)動能力檢測：

細(xì)胞劃痕實驗是體外模擬細(xì)胞遷移能力和修復(fù)能力快捷的檢測方法。在長滿的細(xì)胞培養(yǎng)板或者培養(yǎng)皿中，沿著中線使用移液器槍頭或者其他硬物劃1-3條平行的直線，去除中線的細(xì)胞，細(xì)胞在0h、12h、24h后，觀察細(xì)胞往中線遷移情況，判斷細(xì)胞遷移能力。

一般流程：細(xì)胞接種培養(yǎng)-劃痕-不同時間點(diǎn)拍照

細(xì)胞遷移和侵襲實驗是體外模擬細(xì)胞遷移和侵襲能力的檢測方法。使用不同孔徑的聚碳酸酯膜transwell小室放入培養(yǎng)板中，將細(xì)胞接種于小室中，利用培養(yǎng)液成分的差異誘導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動，檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力的差異。

一般流程：transwell小室準(zhǔn)備-細(xì)胞接種-細(xì)胞培養(yǎng)-transwell小室染色-顯微鏡拍照

                                       圖 A 細(xì)胞劃痕實驗圖；B，C 細(xì)胞遷移和侵襲實驗圖

透射電鏡觀察自噬小體方法

利用光學(xué)顯微鏡，借助相應(yīng)的染色方法，可以觀察細(xì)胞凋亡時會出現(xiàn)的一系列形態(tài)特征。常用的染色法包括臺盼藍(lán)、橙 / 化乙啶（AO/EB）、Giemsa 和 HE 法等。在光學(xué)顯微鏡下可以觀察到核固縮、質(zhì)濃縮和凋亡小體等典型的凋亡現(xiàn)象。

電鏡形態(tài)學(xué)觀察法是一種比較經(jīng)典、可靠的方法，被認(rèn)為是確定細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。電鏡下凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為染色質(zhì)凝集、核濃縮、核裂解、胞漿收縮和胞膜具有發(fā)泡現(xiàn)象及凋亡小體出現(xiàn)等。

選擇實驗外包公司需要注意哪些事項？

報價

報價單一定要有明細(xì)。規(guī)范的外包公司會根據(jù)實驗方案里的各項內(nèi)容進(jìn)行核算報價，材料是多少、人工檢測是多少，可以看到每一筆錢花在哪里，避免籠統(tǒng)的報價。另外注意不要一味地追求低價，做過實驗的都知道實驗成本，外包還需要考慮人工成本。如果價格過低，實驗數(shù)據(jù)就難以保證可靠和來源了。公司先后獲得“江蘇省民營科技企業(yè)”、“江蘇省科技型中小企業(yè)”、“江蘇省專精特新中小企業(yè)”等榮譽(yù)資質(zhì)，連續(xù)多年被評為“東南大學(xué)國家大學(xué)科技園企業(yè)”。當(dāng)然報價也不能虛高，做好是能在有限的經(jīng)費(fèi)中盡量保證課題完整性。可以要求公司根據(jù)預(yù)算來調(diào)整優(yōu)化方案，盡可能節(jié)約成本。