細(xì)胞實(shí)驗(yàn)介紹——慢病毒建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系

慢病毒包裝：公司使用3質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)，慢病毒系統(tǒng)使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G，過表達(dá)慢病毒系統(tǒng)使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三質(zhì)粒系統(tǒng)，將質(zhì)?；靹蚝笫褂昧姿徕}轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，培養(yǎng)48h后，收集上清。置于37目，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周，計(jì)數(shù)含50個(gè)細(xì)胞以上得克l隆，計(jì)算細(xì)胞集落形成率，Spotll采集圖像。使用genecopo公司慢病毒顆粒純化試劑盒將慢病毒純化。純化后留取部分檢測(cè)病毒滴度，其余病毒凍存于-80℃冰箱中。

滴度檢測(cè)：將病毒顆粒使用梯度稀釋，分別293T細(xì)胞，72h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況。根據(jù)細(xì)胞熒光量計(jì)算病毒滴度。

細(xì)胞：在病毒前一天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，接種約10000個(gè)細(xì)胞于12孔板中，培養(yǎng)過夜后使用無(wú)培養(yǎng)基稀釋病毒，加入12孔板中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行，病毒數(shù)量根據(jù)推薦細(xì)胞的MOI加入（若無(wú)推薦MOI，需做病毒梯度：1,5,10,50,100 5個(gè)梯度對(duì)細(xì)胞），6h后去除含病毒溶液，加入完全培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度。Phagophore的特征為:新月狀或杯狀，雙層或多層膜,有包繞胞漿成分的趨勢(shì)。同時(shí)加入puromycin對(duì)細(xì)胞篩選，篩選約2周時(shí)間。細(xì)胞篩選好后，使用定量PCR和Western blot檢測(cè)目的基因的穩(wěn)定表達(dá)情況。

實(shí)驗(yàn)流程：慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建-HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞-病毒收集-病毒純化-病毒滴度檢測(cè)-細(xì)胞-穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞篩選-穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞鑒定

結(jié)果示例：

                                               圖 A 病毒滴度檢測(cè)；B 目的細(xì)胞病毒效果圖

自噬(autophagy)是細(xì)胞受到刺激后吞噬自身的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器，終將吞食物在溶酶體內(nèi)降解的過程,自噬體(autophagosome)為雙層膜包被的圓形或橢圓形結(jié)構(gòu),內(nèi)含細(xì)胞質(zhì)、長(zhǎng)壽蛋白質(zhì)和異常蛋白聚集物，損傷或多余細(xì)胞器如線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和微體、

病毒和細(xì)菌等。由于zhong瘤組織這種新生血管結(jié)構(gòu)及功能異常，且血管基質(zhì)不完善，這種微血管容易發(fā)生滲漏，因此腫liu細(xì)胞不需經(jīng)過復(fù)雜的侵襲過程而直接穿透到血管內(nèi)進(jìn)入血流并在遠(yuǎn)隔部位形成轉(zhuǎn)移。單丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine,MDC是一種熒光色素，是嗜酸性染色劑，通常被于檢測(cè)自噬體形成的特異性標(biāo)記染色劑,其檢測(cè)激發(fā)濾光片波長(zhǎng)355nm ,阻斷濾光片波長(zhǎng)512nm。Leagene MDC染色液適用于培養(yǎng)細(xì)胞的自噬染色，可與EB合用雙染。

透射電鏡觀察自噬小體方法

利用光學(xué)顯微鏡，借助相應(yīng)的染色方法，可以觀察細(xì)胞凋亡時(shí)會(huì)出現(xiàn)的一系列形態(tài)特征。常用的染色法包括臺(tái)盼藍(lán)、橙 / 化乙啶（AO/EB）、Giemsa 和 HE 法等。在光學(xué)顯微鏡下可以觀察到核固縮、質(zhì)濃縮和凋亡小體等典型的凋亡現(xiàn)象。

電鏡形態(tài)學(xué)觀察法是一種比較經(jīng)典、可靠的方法，被認(rèn)為是確定細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。電鏡下凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為染色質(zhì)凝集、核濃縮、核裂解、胞漿收縮和胞膜具有發(fā)泡現(xiàn)象及凋亡小體出現(xiàn)等。