基因的分子手術(shù)是相當(dāng)復(fù)雜的過程，其中zui重要的是連接酶

互補(bǔ)堿基之間的配對，形成雙鏈。并在DNA連接酶的作用下，使同一DNA分子的兩端連接成環(huán)狀，或使兩個(gè)分子連成一大的線狀分子。不同限制性內(nèi)切酶切割DNA產(chǎn)生的三種不同類型的末端。

基因的分子手術(shù)是相當(dāng)復(fù)雜的過程，除了需要限制性內(nèi)切酶外，還需要其他- -些工具酶包括連接酶、DNA 聚合酶、RNA聚合酶、核酸酶、末端修飾酶等，對DNA或RNA進(jìn)行各種各樣的修飾。其中zui重要的是連接酶。

T4 RNA連接酶

用途：用RNA 3'末端標(biāo)記；RNA和RNA分子間連接；寡核苷酸的環(huán)化；tRNA修飾；5' RACE中寡核苷酸連接到cDNA單鏈；在蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)引入非天然氨基酸。

來源：由大腸桿1菌表達(dá)，表達(dá)基因的來源為T4嗜菌體。

活性定義：37℃30分鐘內(nèi)，催化1 nmol 5'-[P]-(A)12-18成為磷酸酶不能消化的環(huán)形產(chǎn)物所需的酶量定義為1個(gè)活性單位。

活性檢測條件：50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP，10μM 5'-[P]-(A)12-18(10μM in 5'-termini)。

純度：不含DNA內(nèi)切酶和外切酶，不含RNA酶，不含磷1酸酯酶。

酶儲存溶液：10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM DTT，50mM KCl，0.1mM EDTA，50%(v/v)glycerol。

Reaction Buffer(10X)：500mM HEPES-NaOH(pH8.0 at 25℃)，100mM MgCl2，100mM DTT。

DNA copy主要的特點(diǎn)是半保留copy、半不連續(xù)copy。在copy過程中，原來雙螺旋的兩條鏈并沒有被破壞，它們分成單獨(dú)的鏈，每一條舊鏈作為模板再合成一條新鏈，這樣在新合成的兩個(gè)DNA分子中，一條鏈?zhǔn)桥f的而另外一條鏈?zhǔn)切碌?，因此這種copy方式被稱為半保留copy。

DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，一條是 5'→3'方向，另一條是 3'→5'方向。在copy起點(diǎn)處，兩條鏈解開形成copy泡(replication bubble ), DNA向兩側(cè)copy形成兩個(gè)copy叉(replication fork)。隨著DNA的不斷解旋，兩條鏈變成單鏈形式，可以作為模板合成新的互補(bǔ)鏈。但是，生物細(xì)胞內(nèi)所有的DNA聚合酶都只 能催化 5'→3'延伸。因此，以3 '→5'的鏈為模板鏈時(shí)，DNA聚合酶可以沿 5'→3'的方向合成互補(bǔ)的新鏈，這條鏈稱為前導(dǎo)鏈(leading strand )。當(dāng)以另一條鏈為模板時(shí)則不能連續(xù)合成新鏈，這條鏈稱為滯后鏈(lagging strand )。這時(shí)，DNA聚合酶從copy叉的位置開始向遠(yuǎn)離copy叉的方向合成1?2 kb的新鏈片段，待copy叉向前移動相應(yīng)的距離后，又重復(fù)這一過程，合成另一個(gè)類似大小的新鏈片段，這些片段被稱為岡崎片段(Okazaki fragment)。zui后，由另一種DNA聚合酶和DNA連接酶負(fù)責(zé)把這些岡崎片段之間的RNA引物除去，并把缺口補(bǔ)平，使岡崎片段連成完整的DNA鏈。這種前導(dǎo)鏈的連續(xù)copy和滯后鏈的不連續(xù)copy在生物細(xì)胞中是普遍存在的，稱為DNA的半不連續(xù)copy。

置換合成法。該方法利用鏈在反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生的DNA RNA雜交鏈不用堿變性，而是在dNTP存在下。利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切口和缺口。從而產(chǎn)生一系列RNA引物，使之成為合成第二鏈的引物。在大腸DNA聚合酶工的作用下合成第二鏈。該反應(yīng)有3個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)：①非常有效；②直接利用鏈反應(yīng)產(chǎn)物，無須進(jìn)一步處理和純化；③不必使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA中的單鏈發(fā)夾環(huán)。