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發(fā)布時(shí)間:2021-06-08 07:46  
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生物分子的分離可以根據(jù)其尺寸大小、表面電荷、疏水性能、及與配基的親和作用性能的差異分別采用分子篩,離子交換,疏水,親和等層析分離模式。為了率把目標(biāo)生物分子從復(fù)雜樣品里分離出來,并保持其生物活性,用于分離純化的層析介質(zhì)材料必須滿足苛刻的要求。層析介質(zhì)的性能主要取決于其介質(zhì)材料組成、形貌、粒徑大小、粒徑分布、孔徑大小和分布、功能基團(tuán)、及表面親水性能等。
傳統(tǒng)生物層析介質(zhì)不能有效用于病毒分離純化很主要的原因是其孔徑太小,病毒不能擴(kuò)散到傳統(tǒng)層析介質(zhì)的內(nèi)孔里,因此可及比表面積低,吸附載量低,而超大孔單分散層析介質(zhì)由于粒徑均勻,孔徑大(>400 納米)因此病毒可以有效的擴(kuò)散到孔內(nèi)部空間,使得靜態(tài)吸附載量大幅度提升。超大孔結(jié)構(gòu)還可以有效降低病毒與填料表面配基之間多位點(diǎn)結(jié)合,避免亞基的解聚,使得病毒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性得到大幅度的提高。另外超大孔聚合物層析介質(zhì)用于病毒及類病毒(疫l苗)分離純化的優(yōu)點(diǎn)是其分離模式與傳統(tǒng)生物制藥層析分離純化方法基本一樣,容易放大生產(chǎn),重復(fù)性好。但超大孔層析介質(zhì)制備技術(shù)難度大,且其機(jī)械強(qiáng)度差,耐壓性差,容易破碎,導(dǎo)致篩板堵塞,壓力升高等缺點(diǎn)。雖然納微已經(jīng)可以制備孔徑大于高達(dá)800納米的超大孔徑聚合物微球,但要滿足病毒大規(guī)模分離純化,還需要進(jìn)一步解決超大孔微球機(jī)械強(qiáng)度問題。
以下為納微超大孔徑DEAE離子交換層析介質(zhì)在流l感病毒(H5N2)純化中的數(shù)據(jù),結(jié)果顯示超大孔介質(zhì)對(duì)流l感病毒的分離純化比傳統(tǒng)層析介質(zhì)具有明顯的優(yōu)勢。
以純化溶瘤病毒為例,由于其在生產(chǎn)過程中存在宿主蛋白等雜質(zhì),純化前 SEC測試純度為6.5%。純化采用兩種基質(zhì)相同的介質(zhì),其表面化學(xué)功能也很一致,主要區(qū)別是前者是無孔實(shí)心的層析介質(zhì),而后者是傳統(tǒng)的多孔層析介質(zhì)。層析純化的方法是陰離子交換吸附然后梯度洗脫(Bind-elute)模式。從層析圖譜可以看出,在洗脫及CIP過程中無孔介質(zhì)洗脫雜質(zhì)更小,峰值更低,意味著上樣過程中結(jié)合的雜質(zhì)會(huì)更少,有利于表面結(jié)合的病毒分子純化。通過對(duì)層析洗脫液SEC純度分析比較,發(fā)現(xiàn)用傳統(tǒng)的多孔層析介質(zhì)實(shí)驗(yàn)得到的病毒樣品純度為54%(圖 ),而用無孔的同類型介質(zhì)實(shí)驗(yàn)得到的病毒純度達(dá)到接近90%(圖 )。
連續(xù)層析提高生產(chǎn)效率 隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的迅猛發(fā)展,蛋白表達(dá)量不斷增加以及新興的連續(xù)灌流培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展對(duì)下游純化效率提出越來越高的要求。批次層析越來越難以滿足生產(chǎn)的需求,而連續(xù)層析由多根串聯(lián)的層析柱組成,因?yàn)榈诙涌梢猿薪硬⑽綇母鶎游鲋鞔┑?,因此根柱子可以持續(xù)上樣到更高的蛋白穿透從而顯著提高層析柱的使用載量,進(jìn)而提高介質(zhì)利用率,降低生產(chǎn)成本。連續(xù)層析可以極大提高設(shè)備的利用率,縮短生產(chǎn)周期,還可以減少緩沖液的消耗。