反相色譜影響因素(1)柱長有機小分子和肽類的分辨率隨柱長的增加而增加．但是柱長增加并不能使蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分辨率顯著增加．它們在較短的柱子上往往也有很好的分離效果。(2)流動相的流速。有機小分子和肽類的分辨率對流動相流速非常敏感。(3)固定相的選擇硅膠、鍵合固定相(如C18)、離子交換樹脂、聚酰胺、氧化鋁、凝膠等都可以作為色譜柱的填料。而蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分辨率則不然。流速越小，柱子越長，色譜峰的寬度就越大，分辨率就越小。制備色譜上樣過程中的流速對動態(tài)吸附容量影響很大。(3)溫度。溫度上升，流動相黏度下降，流動速度加快，且流動相與固定相之間的傳質(zhì)速度加快，使分辨率增加。同時，溫度上升，分子熱運動增加，疏水性作用減弱。升高溫度要考慮目標物質(zhì)的熱穩(wěn)定性。(4)流動相組成。流動相的極性越大，溶質(zhì)的分配系數(shù)越大，洗脫時間越長。RPC多采用降低流動相極性(水含量)的線性梯度洗脫法。水是極性強的溶劑，在反相色譜中常常和基礎(chǔ)溶劑配合使用，向流動相中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機溶1劑，以得到不同強度的流動相，這些有機溶1劑稱為修飾劑。反相色譜中的有機溶1劑。此外，乙醇、四氫呋1喃、異丙1醇及二氧六環(huán)也常被用作修飾劑。有機溶1劑梯度的大小也會影響分辨率，一般梯度越小，分辨率越大。

反相色譜中樣品的保留值主要由固定相比表面積、鍵合相種類和濃度決定，保留值通常隨鏈長增長或鍵合相的疏水性增強而增大．對于非極性化合物通常遵循以下規(guī)則：(弱)非鍵合硅膠《基<C1(TMS)<C3<C4<<C8≈C18(強)。溶質(zhì)保留值與固定相表面積成正比，普通載體(80 A°)的比表面積約為250 m2/g，而300A°孔徑載體的比表面積約為60 m2/g。但是從我們長期使用的實際效果來說，只要能保證水的質(zhì)量，這一步完全可以也應(yīng)當去除。當其他條件相同時，溶質(zhì)在300A°孔徑(低表面積)色譜柱上的保留值大約為80A°孔徑色譜柱上保留值的1/4(60：250)，小孔隙柱如高保留的C18柱或石墨柱有利于強親水性樣品洗脫。樣品的保留值也可以通過改變流動相組成或溶劑強度來調(diào)整，溶劑強度取決于的性質(zhì)和其在流動相中的濃度。在反相色譜中，采用高溶劑強度、低極性的流動相時可獲得較低的保留值。固定相的不同也可以導(dǎo)致選擇性發(fā)生變化，基柱、柱、C8柱、C18柱等的選擇性有很大差異，一般應(yīng)優(yōu)先考慮C8柱、C18柱，然后是基柱，再次是柱。據(jù)統(tǒng)計，近80%的有機物及無機物可以用液相色譜法進行分離．其中反相色譜中的C18柱是液相色譜中為常用的一類色譜柱。

液相色譜儀在使用過程中難免會接觸到腐蝕性的物質(zhì)。這些腐蝕性物質(zhì)不論是氣體、液體還是固體，都有可能損壞儀器的材料和零部件，降低色譜儀的使用壽命。在使用時要盡量避免這種情況的出現(xiàn)。     液相色譜儀流動相類型有多種，流動相性質(zhì)對樣品的分離影響很大。

液相色譜儀流動相類型：     1、按組成可分：單組分流動相和多組分流動相。根據(jù)其分離原理，有吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜與排阻色譜等方法。     2、按極性可分：極性流動相、弱極性流動相和非極性流動相。     3、按作用可分：底劑和洗脫劑。     4、按使用方式可分：等度流動相和梯度流動相。     5、按用途可分：己烷、乙1酸乙1酯、乙醇、乙1腈和水等。     采用二元或多元組合溶劑作為流動相，可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性和增加選擇性，改進分離和調(diào)整出峰時間。

低壓色譜（LPLC）柱壓一般低于5bar（或75psi）。洗脫除另有規(guī)定外，通常按流動相洗脫能力大小，遞增變換流動相的品種和比例，分別分部收集流出液，至流出液中所含成分顯著減少或不再含有時，再改變流動相的品種和比例。 低壓色譜一般是由蠕動泵、進樣閥和檢測器組成，可以連續(xù)化，實現(xiàn)自動的梯度淋洗和餾分收集等操作。色譜柱管一般是玻璃或聚合物材料的，長度一般為240-440mm，內(nèi)徑為10-40mm。 對于大多數(shù)在紫外區(qū)有吸收的物質(zhì)，光學(xué)檢測器很常用。填料一般使用軟質(zhì)的葡聚糖、瓊脂糖、纖維素、合成高聚物或離子交換劑，粒徑一般為40-60μm。