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發(fā)布時間:2021-06-27 04:11  

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在real-time Q-PCR技術(shù)中,無論是相對定量還是標準曲線定量方法仍存在一些PCR定量方法均有的問題有待解決。在標準曲線定量中,標準品的制備是一個必不可少的過程。目前由于無一統(tǒng)一標準,各個實驗室所用的生成標準曲線的樣品各不相同,致使實驗結(jié)果缺乏可比性。此外,用real-time Q-PCR來研究mRNA時,受到不同RNA樣本存在不同的逆轉(zhuǎn)錄(RT)效率的限制。還有,由于PCR反應(yīng)和檢測都在反應(yīng)管中進行,樣品污染的幾率大大降低,無需擴增后的實驗操作。在相對定量中,其前提是假設(shè)內(nèi)源控制物不受實驗條件的影響的,合理地選擇合適的不受實驗條件影響的內(nèi)源控制物也是實驗結(jié)果可靠與否的關(guān)鍵。

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與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比,Real-time Q-PCR的不足之處是:(1)由于運用了封閉的檢測,減少了擴增后電泳的檢測步驟,因此也就不能監(jiān)測擴增產(chǎn)物的大?。唬?)因為熒光素種類以及檢測光源的局限性,從而相對地限制了real-time Q-PCR的復(fù)合式(multiplex)檢測的應(yīng)用能力;在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。(3)目前real-time Q-PCR實驗成本比較高,從而也限制了其廣泛的應(yīng)用。


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生豬屠宰企業(yè)作為產(chǎn)業(yè)鏈條上的重要主體,防控動物疫病、保證產(chǎn)品質(zhì)量安全是應(yīng)盡的責任。屠宰廠(場)生產(chǎn)設(shè)施設(shè)備和環(huán)境一旦被污染,病毒更易長期存活,更易在生豬和豬肉產(chǎn)品中循環(huán)擴增,成為病毒的“儲存器”“擴增器”。生豬屠宰廠(場)連接著生豬產(chǎn)銷等上下游環(huán)節(jié),便于“順藤摸瓜”及時發(fā)現(xiàn)和追溯潛在風險。相比其他環(huán)節(jié),在生豬屠宰廠(場)開展檢測更容易采集樣品,實現(xiàn)i大限度的檢測覆蓋面,結(jié)合臨床和剖檢情況綜合判斷。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯i仿相,中間層以及無色水相上層。從目前情況看,大部分屠宰廠(場)能夠開展非洲病毒自檢。

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對檢測的要求是:生豬屠宰廠(場)應(yīng)當在駐場官i方獸醫(yī)監(jiān)督下,按照生豬不同來源實施分批屠宰,每批生豬屠宰后,對暫儲血液進行取樣并檢測非洲病毒;或者根據(jù)實際情況,在生豬進場前以生豬運輸車輛為單位采集全部生豬血液樣品,混合后進行檢測。屠宰過程中發(fā)現(xiàn)疑似非洲典型病變的,要立即停止屠宰,將可i疑生豬轉(zhuǎn)至隔離間,并采集病變組織和血液樣品進行檢測。②操作簡單、用時短,整個提取流程只有四步,大多可以在36-40分鐘內(nèi)完成。對檢測結(jié)果應(yīng)用的要求是:屠宰廠(場)檢測非洲病毒為陰性且按照檢疫規(guī)程檢疫合格的,駐場官i方獸醫(yī)方可出具動物檢疫證明,并注明檢測方法、日期和結(jié)果等信息。


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相對定量可以對每個樣本中模版的其實水平之間的差異進行精i確比較,沒必要知道模版的確切拷貝數(shù),并且樣本模板中的相對水平不用使用標準曲線就可以確定。相對定量分析以實時PCR方式執(zhí)行,在實時PCR分析過程中,PCR基因擴增一直在監(jiān)控中,在PCR進行期間進行數(shù)據(jù)采集,而不是在PCR結(jié)束時(終點PCR)才獲取數(shù)據(jù)。根據(jù)應(yīng)對流行性腹瀉病毒的經(jīng)驗,在不影響動物性能和飼料成本的情況下,替換原料的可行性使得很多生產(chǎn)者不再使用豬源原料。在實時PCR中,反應(yīng)是在目標的擴增早被監(jiān)測到時用循環(huán)中的時間點來描述的,而不是在PCR結(jié)束時通過目標的累計數(shù)來描述。

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在PCR反應(yīng)體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后,發(fā)射熒光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結(jié)合,因此可以通過溶解曲線,確定PCR反應(yīng)是否特異。01℃的定量PCR儀,而該公司新近推出的Rotor-Gene6000更可達到±0。


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定量PCR已經(jīng)從基于凝膠的低通量分析發(fā)展到高通量的熒光分析技術(shù),即實時定量PCR。實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出,由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。而熒光定量PCR可以在反應(yīng)進行過程中進行累積擴增產(chǎn)物的分析和檢測,即“實時”。實時定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產(chǎn)物的量,并據(jù)此推斷目的基因的初始量,不需要取出PCR產(chǎn)物進行分離。

PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;但在許多情況下,研究者們已不再滿足于得知某一特異DNA序列的存在與否,他們更著眼于對其進行精i確的核酸定量。PCR擴增時,Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步.