自噬(autophagy)是細(xì)胞受到刺激后吞噬自身的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器，終將吞食物在溶酶體內(nèi)降解的過(guò)程,自噬體(autophagosome)為雙層膜包被的圓形或橢圓形結(jié)構(gòu),內(nèi)含細(xì)胞質(zhì)、長(zhǎng)壽蛋白質(zhì)和異常蛋白聚集物，損傷或多余細(xì)胞器如線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和微體、

病毒和細(xì)菌等。單丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine,MDC是一種熒光色素，是嗜酸性染色劑，通常被于檢測(cè)自噬體形成的特異性標(biāo)記染色劑,其檢測(cè)激發(fā)濾光片波長(zhǎng)355nm ,阻斷濾光片波長(zhǎng)512nm。Leagene MDC染色液適用于培養(yǎng)細(xì)胞的自噬染色，可與EB合用雙染。目前有多種分選人、小鼠、大鼠以及非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)細(xì)胞的MACS直標(biāo)微珠可供選用。

流式細(xì)胞分選

流式細(xì)胞分選技術(shù)是利用流式細(xì)胞分選儀，以高能量激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下被熒光色素染色的單細(xì)胞或微粒,測(cè)量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強(qiáng)度,從而對(duì)細(xì)胞(或微粒)的物理、生理、生化、免yi、遺傳、分子生物學(xué)性狀及功能狀態(tài)等進(jìn)行定性或定量檢測(cè)的--種現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)，它可根據(jù)發(fā)射光的熒光強(qiáng)度和波長(zhǎng)將發(fā)光顆粒亞群分開(kāi)并可實(shí)現(xiàn)單ke隆分選，能復(fù)雜樣本中的細(xì)胞進(jìn)行鑒定、分類(lèi)、定量和分離,單次可同時(shí)對(duì)其中一種到四種特定細(xì)胞進(jìn)行超高速分選純化、高通量單分選或細(xì)胞芯片制備。分選后的細(xì)胞能直接用于培養(yǎng)、移植、核酸提取、單細(xì)胞PCR擴(kuò)增或原位雜交等，可進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞基因、蛋白、功能水平的研究和不同細(xì)胞之間的差異化研究。硬件中樣本細(xì)胞丟棄的比例低于5%，保證樣本中目標(biāo)細(xì)胞的高回收率。在長(zhǎng)滿的細(xì)胞培養(yǎng)板或者培養(yǎng)皿中，沿著中線使用移液器槍頭或者其他硬物劃1-3條平行的直線，去除中線的細(xì)胞，細(xì)胞在0h、12h、24h后，觀察細(xì)胞往中線遷移情況，判斷細(xì)胞遷移能力。

細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的污染及解決方法

霉菌污染

正常情況下，培養(yǎng)基在 37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩三天，在倒置顯微鏡下仍保持透明，無(wú)雜質(zhì)。一旦出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，顯微鏡下可見(jiàn)絲狀和團(tuán)塊狀漂浮物，菌絲明顯。此時(shí)，雖然細(xì)胞仍在生長(zhǎng)，但它們的生命狀態(tài)會(huì)在長(zhǎng)時(shí)間后逐漸惡化。

解決方法：用硫酸銅溶液擦拭 CO2 培養(yǎng)箱，向托盤(pán)中加入飽和硫酸銅或消毒后加入飽和磷酸氫二鈉高鹽溶液，避免霉菌污染。

如果霉菌污染，暫時(shí)轉(zhuǎn)移所有細(xì)胞，并立即使用 guo 氧擦拭培養(yǎng)箱，包括層板和內(nèi)壁。將 guo 氧放在培養(yǎng)箱中一小時(shí)，使蒸汽擴(kuò)散，待 guo 氧氣味消散后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中。值得注意的是，培養(yǎng)箱需要每?jī)蓚€(gè)月定期清洗一次，尤其是在梅雨季節(jié)。用 84 消毒液、清水和 75% 酒精連續(xù)擦拭培養(yǎng)箱，用紫外線照射也是一種有效的方法。自噬流檢測(cè)自噬是調(diào)節(jié)真核細(xì)鵬生長(zhǎng)、和能量代謝的重要生物學(xué)機(jī)制。

為防止霉菌污染，需添加 3μg/ml 、抑制素、fang

線菌素 D 或青鏈。一旦被污染，就不可能恢復(fù)，即使使用上述，也沒(méi)有什么區(qū)別。對(duì)于支原體污染的細(xì)胞培養(yǎng)，選擇是丟棄污染的培養(yǎng)物，并用使用新鮮的無(wú)支原體的儲(chǔ)存液，消毒環(huán)境。如果所有的細(xì)胞都被污染了，那可能是整個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)污染了。因此，必須對(duì)培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)設(shè)備進(jìn)行檢查。)4、MDC(Monodansylcadaverine，單丹磺酰尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的。如果只是個(gè)別污染，可能是操作問(wèn)題，有必要注意實(shí)驗(yàn)操作步驟的規(guī)范。

選擇實(shí)驗(yàn)外包公司需要注意哪些事項(xiàng)？

技術(shù)支持

盡量有專門(mén)的技術(shù)負(fù)責(zé)對(duì)接項(xiàng)目，或者有技術(shù)服務(wù)群。隨時(shí)溝通項(xiàng)目問(wèn)題，定期匯報(bào)實(shí)驗(yàn)進(jìn)展。這樣能把控實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，結(jié)果數(shù)據(jù)有疑問(wèn)也可以交流，不要實(shí)驗(yàn)做完就沒(méi)人管了。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

明確提供實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)、原始圖片，并有保密協(xié)議不外傳數(shù)據(jù)和客戶的信息。確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的完整性、唯獨(dú)性、真實(shí)性。這也是找實(shí)驗(yàn)外包很關(guān)心的原則。另外結(jié)果盡量有實(shí)驗(yàn)報(bào)告形式，包含所用材料、實(shí)驗(yàn)步驟和結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，方便寫(xiě)文章時(shí)直接使用。另外實(shí)驗(yàn)都是有不確定性的，如果外包公司能保證一定能做出預(yù)期的結(jié)果，那多半是不靠譜的。調(diào)亡I期(pro-apoptosisnuclei)的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤(pán)繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象(cavitati)的空泡結(jié)構(gòu)。做實(shí)驗(yàn)不怕出問(wèn)題，的外包公司會(huì)負(fù)責(zé)到底，有問(wèn)題反饋再處理就好。